《医药基因工程》PPT课件.ppt

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1、医药基因工程,小组成员:王强 曲少丹 孔庆斌 苍迪 于爽,自1972年DNA重组技术诞生以来,基因工程技术得到了飞速的发展,并作为现代生物技术的核心服务于人类.基因工程技术不仅在农业发展中起到了重要作用,而且在与国计民生相关的医疗领域也展露出独特的优越性.基因工程药物就是利用基因工程技术生产的药品,在我国药品时常上,基因工程药品主要有基因工程乙肝疫苗,重组干扰素,重组人红细胞生成素等22种自主开发的基因工程药物.,第一节 基因工程药物的开发状况,一、基因工程药物的分类1.按结构著称的不同,可分为蛋白多肽类药物、基因工程疫苗和核酸类药物;2.按作用方式可将基因工程药物分为基因水平作用药物、转录水

2、平药物、蛋白质水平药物;3.按基因工程药物作用机理也可分为三类，其一,蛋白或多肽药品;其二,基因工程疫苗;其三,反义核酸、核酶和RNAi.,二、基因工程药物的发展,反应器的变迁 早期大多数蛋白多肽类基因工程药物都是通过细菌和酵母菌等微生物来表达的，并且现在还在使用.后来发展了真核生物细胞表达系统,利用离体培养的昆虫细胞和脊椎动物细胞表达蛋白多肽类药物.不论是原核生物表达系统,还是真核生物表达系统,表达产物都需要提取,工艺复杂、成本昂贵;因此,近些年发展的动植物生物反应器为基因工程药物的开发带来了美好前景.,从基因工程到蛋白质工程,随着技术的进步,人们已经不再满足自然存在的蛋白药物产品,通过蛋白

3、质工程可以获得修改了氨基酸序列的蛋白质或多肽.通过定点诱变、功能域交换、分子进化等手段,已经开发出一些活性提高、适应性改善和专一性增强的蛋白药物.从蛋白药物到核酸药物在蛋白类基因工程药物的基础上发展出了核酸类基因工程药物,作为一类新的药物，核酸类基因工程药物可产生蛋白的基因,通过破坏和扩大基因的功能来克服疾病,具有更强的选择性和更高的效率.目前核酸类药物正处于开发阶段,进入市场的还很少.,三、基因工程药物的产业化状况 基因工程制药是一个高技术、高投入、长周期、高风险及高收益的行业,一方面会吸引更多的企业进入,另一方面也会导致企业的重组甚至退出,是其成为最活跃、发展最快的行业之一,第二节 基因工

4、程蛋白和多肽药物一、基因工程胰岛素 早期用于治疗人类糖尿病的胰岛素来源于牛和猪的胰腺,动物胰岛素和人类胰岛素很相似,但还是有差异,而且数量有限.通过基因工程手段可以批量生产人类胰岛素,为糖尿病患者带来福音,尽管这类药物和动物胰岛素一样会引发免疫反应,但仍有其应用价值.,二、基因工程人红细胞生成素 EPO又成促红细胞生成素或红细胞生产刺激因子,是一类造血生长因子,刺激和调节哺乳动物红细胞的生成,维持外周血细胞处于正常水平.目前只有应用基因工程技术生产EPO才能满足患者的需求.,三、基因工程干扰素 干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白细胞因子.早期干扰素的制备是通过诱导或

5、重复诱导天然或人工培养的人体细胞或血细胞产生天然干扰素,但价格昂贵而且产量有限,从而限制了临床应用.利用基因工程技术生产干扰素则完全解决了传统制备方案的弊端.,四、基因工程疫苗,疫苗一般是由灭活或减毒的病原体做成的可预防相应病原物引起疾病的药物,通过接种人或动物在其体内建立抗感染免疫反应而产生保护作用.将基因工程技术应用于疫苗生产所得的疫苗即为基因工程疫苗,其可有效的避免潜在的污染物.基因工程疫苗已经成为热门生物技术之一.五、基因工程抗体 在临床上,抗体可用于抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反应、抗血栓形成和解毒,以及构件独特型疫苗、治疗自身免疫性疾病和变态反应疾病,此外还可以用于以外诊断和发挥

6、体内药物导向作用.基因工程抗体在临床上可发挥更多更重要的作用.,第三节 基因工程抗体,一、抗体的结构,抗体分子是由4条多肽链组成的四聚体,即由2条相同的轻链(L)和2条相同的重链(H)组成,重链之间以及轻链与重链之间通过二硫键连接,呈Y字型结构.重链由450个氨基酸组成(如抗体LgG),轻链由214个氨基酸组成.抗原的识别位点位于轻链和重链的N端区域(相当于轻链N端一半的部位),该区称为抗体的可变区(variable region,V区).更精确的说抗原的识别和结合位点是V区的3个互补决区(complementarity determining region,CDR),也称超变区(hyperv

7、ariable region),每个CDR长约516个氨基酸.,二、天然抗体的局限性,抗原往往具有多种不同抗原决定簇,从而刺激抗体产生多克隆抗体.这种抗体是不均一的,会影响检测抗原的特异性及敏感性,在临床上应用受到很大限制.单克隆抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一抗体,可视为第二代抗体,具高度特异性,均一性,且亲和力强,效价高,在临床上发挥了重要作用.然而,单克隆抗体在临床应用中也存在一些问题:1.单克隆抗体具有免疫原性.2.半衰期短.3.吸收差.4.生产复杂,价格较高.,以上这些问题,基因工程抗体可很好地解决,包括利用基因工程手段生产抗体,以及将抗体基因进行切割，拼接或修饰，产

8、生新性状的抗体甚至产生新型抗体。,三、基因工程抗体的种类1.单克隆抗体的人源化 为了解决鼠源抗体的免疫原性问题，可采用两种方式改造抗体，即构建人鼠嵌合抗体和人源化抗体。（1）人鼠嵌合抗体：通过基因重组技术，将鼠源单克隆抗体的Fv片段替换人源抗体的相应片段所制成的。（2）人源化抗体：是对嵌合抗体进一步改进的结果，即仅用鼠源单克隆抗体的CDR区替换人源抗体的CDR所获得的杂合抗体。,2.小分子抗体 为了解决抗体的穿透性问题，可对抗体进行改造，保留其抗原结合位点，使之成为小分子抗体。根据构建方法的不同，可分为以下4种：（1）Fab抗体。抗体的Fab片段由重链的V区和CH1区与轻链以硫键相连，能发挥抗

9、体的抗原结合功能，其大小只有完整抗体的1/3。（2）单链抗体。将抗体的VH和VL用连接肽连接，形成具有抗原结合能力的单链抗体多肽，即所谓的单链抗体。（3）单域抗体。抗体结合抗原的部位主要在V区，只含有V区的小分子抗体。（4）超变区多肽。抗体与抗原的结合是通过V区的CDR区来实现的，CDR区是抗原抗体结合的最小识别单位。由单个CDR多肽构成的小分子抗体称为超变区抗体。（5）双体抗体。将2种不同抗体的VH和VL区通过连接肽（510个氨基酸）连接，形成“杂交”的单链抗体称作双体抗体。,3.双功能抗体 天然的抗体分子是双价单特异性的，将小分子抗体与其他蛋白如毒素、酶、细胞因子及受体分子连接在一起，可形

10、成一种新型分子，这样的杂合分子也称为双功能抗体，既可以与靶位点结合，又可以将特定的活化分子导向特定部位，发挥其生物学功能。,4.人源性抗体 由于鼠源抗体存在免疫原性，人们一直在努力制备完全人源化的抗体，即人源性抗体。目前主要有2种方法用来制备人源 蛋克隆抗体。（1）噬菌体抗体库。噬菌体抗体库技术是噬菌体表面展示技术在基因工程抗体应用上的一个成功范例，它可以模拟体内B淋巴细胞受到刺激后分化、成熟直至分泌抗体的过程。通过噬菌体表面展示技术，可将目的蛋白或多肽的编码基因与编码M13噬菌体颗粒末端蛋白的基因3构建成融合基因。通过基因重组技术，将全套人抗体重链和轻链的V区基因与M13噬菌体基因3构建成融

11、合基因，在噬菌体表面以抗体FV片段-末端蛋白融合蛋白的形式表达，表达这些融合蛋白的噬菌体群体就构成了噬菌体抗体库。（2）人源性抗体转基因小鼠。通过构建转基因小鼠，可使小鼠产生人源性单克隆抗体。用人的抗体基因转入小鼠并代替小鼠的相应基因，产生能分泌人抗体的转基因小鼠。第一个获得的人源性抗体是抗破伤风类毒素的单克隆抗体。在转基因小鼠基础上，建立了一种产生人抗体的小鼠模型。,5.基因工程抗体的产生（1）大肠杆菌表达系统。大肠杆菌是常用的表达系统，但由于缺乏糖基化能力，以及不利于抗体分子链间形成二硫键，因此主要用来表达抗体的Fab、Fv、ScFv等小分子片段。（2）酵母表达系统。酵母是真核微生物，与原

12、核微生物相比酵母菌能对异源蛋白进行糖基化等修饰，能有效分泌、正确折叠和加工蛋白。与哺乳动物表达系统相比，酵母能在简单培养基上快速生长，是临床和工业生产上重要的蛋白表达系统。（3）哺乳动物细胞表达系统。中国仓鼠卵巢细胞（CHO）抗体表达系统是较成熟的哺乳动物细胞表达系统，它采用最有效的来自人巨细胞病毒启动子，引导抗体基因在CHO细胞中表达。该表达系统能使表达的抗体正确装配、折叠和糖基化；能在无血清培养基中生长，分泌水平高；瞬时表达系统可表达足量抗体，以便对抗体特异性和亲和力做快速鉴定。（4）植物系统表达。通过转基因技术，将抗体轻、重链基因导入不同的烟草植物表达，再将表达轻、重链抗体的植株进行有性

13、杂交，筛选产生全功能抗体的植株。,（5）昆虫表达系统。昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。其中利用杆状病毒在昆虫细胞表达外院蛋白是目前较为流行的表达系统。现在已经利用昆虫表达系统成功地生产了鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、单链抗体及人源单克隆抗体等多种抗体分子，还将抗体分子与尿激酶型纤溶酶原激活物等肿瘤相关蛋白进行了融合表达，这些抗体分子多数能正确装配，完成糖基化过程，具有相当的活性。,第四节 核酸类药物,多种疾病在某种程度上是缺乏或多产生某种蛋白引起的，因此通过蛋白或多肽类药物可解决部分问题。利用核酸作为药物可以达到

14、常规药物无法达到的效果。（第一个核酸药物反义核酸药物Formivisen),根据核酸药物的本质和作用方式，可将其为四大类：反义类核酸药物 核酸免疫 RNA干扰 基因治疗,反义核酸药物 概念：反义核酸是一些人工合成的单链反义分子，可以通 过碱基互补原则与被感染细胞内部的某个靶标mRNA或 DNA结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割 mRNA使其丧失功能。反义核酸参与基因表达在原核生物中是一种普遍的现象。意义：反义核酸对基因表达的有效调控给人类疾病治疗带来了新的希望，将反义核酸作为一种生化药物，有希望在征服人类的大敌如癌症、病毒类引起的疾病、艾滋病和遗传性疾病中发挥重要作用。分类：根据组成和

15、特点可将其分为反义RNA（antisense RNA)、反义DNA（antisense DNA）、肽核酸（peptide nucleis acid,PNA）和核酶（ribozyme）。,核酸疫苗核酸疫苗的工作方式：核酸疫苗（nucleic acid vaccine)又称基因疫苗（gene caccine)或DNA疫苗（DNA vaccine），是利用基因重组技术将编码抗原的基因装入载体，然后直接导入动物体内，通过机体细胞的转录系统合成蛋白，产生的蛋白作为抗原诱导免疫系统产生免疫应答，即通过细胞和体液免疫反应产生抗体，从而达到预防和治疗疾病的目的。免疫载体：核酸疫苗是通过疫苗载体将抗原编码基因导

16、入机体而激发免疫的。进入体内的核酸必须表达出相应的蛋白抗原才能发挥疫苗的作用。为此，疫苗载体起着重要的作用。典型的核酸疫苗载体有pcDNA3.1，以及在此基础上去掉病毒复制单位并用双宿主可用的卡那霉素抗性基因替换氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗性基因的改建载体Pvax1.(见书349页图18-6）,核酸疫苗的优点：第一，安全性好，没有感染的危险；第二，免疫效果好，核酸疫苗能在自身细胞中产生与自然 抗原接近的外源性蛋白，能诱导产生类似自然抗原 的免疫应答；第三，制备简单，只需对编码抗原的基因进行免疫克隆，不需在体外表达和纯化蛋白质；第四，核酸疫苗的本质是核酸分子，因而不同于蛋白质和 活疫苗，可以在室

17、温条件下保存，不存在疫苗的冷 藏和低温运输问题，从而保证DNA疫苗的高效接种 率；第五，免疫应答持久，外源基因的不断表达可持续提供抗 原。,RNA干扰 RNA干扰现象 RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指对应于某种Mrna的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（ds RNA）分子使mRNA发生特异性降解，导致其不能表达的转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing,PTGS)现象。RNAi发挥作用的过程可分为两个阶段：起始阶段：双链RNA分子进入细胞后被Dicer的核酸酶切割为2123个核苷酸长的小分子干扰RNA片段（smal

18、l interfering RNA，siRNA).然后双链siRNA与核酸酶结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing cimplex,RISC)效应阶段:siRNA打开双链从而激活RISC，激活的RISC通过碱基配对与对应的mRNA结合，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。同时，siRNA可作为引物并以mRNA 为模板合成新的ds RNA。RNA干扰的应用(见书351页）,基因治疗基因治疗的思想 基因治疗（gene therapy)是将目的基因放进特定载体中导入靶细胞或组织，通过替换或补偿引起疾病的基因，或者关闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。基因治疗策略：其一，通过导入正常基因的方法来修复缺陷基因的功能或者加强某些原有基因的功能。其二，通过导入抗原、抗体或细胞因子的编码基因到患者体内，改变患者免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。基因治疗的实践基因治疗的工作原理 目的基因导入人体的方法 腺病毒载体重组人p53腺病毒基因治疗药物,谢谢观赏!,