《动物细胞制药》PPT课件.ppt

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1、第五章 动物细胞工程制药,了解动物细胞的形态及生理特点，熟悉生产常用的几种动物细胞的特点和培养条件及大规模培养方法，熟悉动物细胞生物反应器类型及其操作原理，掌握组织工程概念。,细胞是生物体的基本结构单位和功能单位，单细胞生物，一个细胞就是一个个体，而多细胞生物则由许多细胞组成一个个体。我们所看到的生物体都是由多细胞所组成。在多细胞生物体中，由形态结构相似的细胞再组成组织，执行着生物体中的部分功能。,细胞工程（cell engineering）应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和

2、技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。,动物细胞工程,动 物 细 胞 培 养胚胎或幼龄动物的组织器官（细胞来源）,剪碎、胰蛋白酶,分离细胞,单 个 细 胞,洗涤、稀释、分离,原代培养,原 代 细 胞,细 胞 株,传代培养,遗传物质没有发生改变,细 胞 系,遗传物质发生改变,应用,1、生产有价值的蛋白质制品，（如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、动物激素）2、检测有毒物质3、用于某些器官移植,细胞分化 多细胞生物体是由各种各样形态和功能都不同的细胞群所组成

3、。高等动、植物由受精卵细胞开始的胚胎发生过程随着细胞分裂次数的增加而使得早期胚胎的细胞数量也增加许多。其中有些细胞在形态、结构和功能上逐渐发生了差异，这种细胞之间差异的发生过程就是细胞分化。个体发育的过程就是细胞分化的过程，个体的各种器官和组织都是通过细胞分化形成的。,离体细胞的形态贴壁细胞：来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。一般成纤维样或上皮样细胞型。悬浮细胞：细胞无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞。来自血液、淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。兼性贴壁细胞：不严格依赖支持物。,动物细胞的化学组成 水分85%，无机盐1-1.5%，蛋白质7-10

4、%，脂质1-2%，其他有机物1.5%。动物细胞的代谢 糖、脂肪、蛋白质的降解代谢分三阶段：第一阶段是大分子降解为小分子；第二阶段是小分子代谢产生乙酰辅酶A、-酮戊二酸和草酰乙酸；第三阶段是三羧酸循环。动物细胞体外培养的主要能源来自葡萄糖和谷氨酰胺，如何提高DO2？在高密度培养时加部分果糖。,动物细胞的生理特点1、动物细胞的分裂周期长(12-48hr),各类细胞分裂周期时间表,2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象3、正常二倍体细胞的寿命有限4、动物细胞对周围环境敏感5、动物细胞对培养基要求高6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同,动物细胞和微生物细胞的总体差异,动物细胞培养的特性

5、 动物细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性和功能的技术，这些细胞不再形成组织。,细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差需氧少，不耐受强力通风与搅拌群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）培养过程产品分布细胞内外，成本高 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡,细胞生长的类型 贴壁依赖性 来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，才能生长。非贴壁依赖性 细胞无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞。来自血液、淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它们

6、形态呈圆形。,生长特性 贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。,贴壁培养的优点容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。适用于所有类型细胞。,贴壁培养的缺点与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。,细胞培养物的获得原代培养物

7、 在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的组织剪碎成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶处理，使组织解离成单个细胞，放入培养容器中无菌培养。这种原代培养物中含有各种不同分化的细胞类型，它们的生长速率不同，成纤维细胞最易生长，常会在此后的传代培养中占据优势。仔细控制培养基的成分，可以选择性地支持某些细胞类型的生长。,两个专业术语 细胞系：首次分离组织的培养称之为原代培养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的培养物称为细胞株。,转化细胞 正常细胞经过某个转化过程，丧失了对生长控制的敏感性。转化伴随着染色体模式的改变，二倍体变成异倍体。

8、更典型的表现是，贴壁依赖性细胞对贴壁的依赖及细胞密度的抑制发生改变，虽然也许细胞仍需贴壁生长，但可能生长到不止单层。细胞转化有四种主要途径：有些细胞在培养中自发转化。化学转化，某些化学致癌物会增加转化频率。病毒转化。致瘤因子转化。,转化细胞由于有无限寿命，在培养中更易生长，被广泛用于生产生物制品，如重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人们对它们的安全性仍然非常关心，对可能造成的生物危害性进行严格的检测和控制。,肿瘤细胞 肿瘤细胞是来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤细胞与其它细胞融合产生的细胞，如杂交瘤细胞。与转化细胞相比，它们是恶性的，基本上是非贴壁依赖性的。肿瘤细胞有很好的增殖特性，生长速率高。对生长

9、因子的依赖程度低，对培养环境的要求也不那么苛刻。,体外培养所需的一般条件 适宜的培养皿、血清成分、370C、CO25、95100湿度、抗生素。,肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治疗产品生产的主要原因。由于近年来分离纯化技术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认识，对其在生产中的应用有所松动，如杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已用于体内治疗，C127细胞生成重组蛋白的研究也形成了规模。,培养基和培养条件,培养基配制时考虑的因素,pH 多数细胞系在pH7.4下生长得很好。一些正常的成纤维细胞系以7.47.7最好，转化细胞系以pH7.07.4更合适。缓冲 在高细胞密度下，转化细胞系产生大量二氧化碳和乳酸，引

10、起pH下降，需要在培养基中加入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)。,温度 低温下CO2溶解度增加，引起pH变化。黏度 培养基的黏度主要受血清含量的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受损伤小。加入羧甲基纤维素或聚乙烯基吡咯烷增加培养基黏度,细胞培养基的基本组成（1）水 细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物标准可参考医药上注射用水标准，但原则上应高于注射用水标准。,（2）能源和碳源 主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更偏爱蔗糖。在多数

11、培养基中谷氨酰胺作为主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。,（3）氮源 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞合成复杂含氮化合物的前体，还作为必不可少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的种类和浓度有不同的要求，但除了谷氨酰胺外，还有12种氨基酸不能在细胞内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产物产率。,（4）维生素 维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要生物活性

12、化合物，在细胞中多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。,（5）无机离子 无机离子分为两组，一种是含量较高的，包括维持膜电势的（Na+，K+），维持渗透压平衡（Na+，Cl），作为酶的辅因子（Mg2+），促进细胞贴附（Mg2+Ca2+），起缓冲作用（HPO42-，HCO3-）；另一种势微量元素，如铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。,（6）脂类和磷脂前体 在使用血清的细胞培养中，脂类来自血清，在无血清培养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞，对某种脂类有很高的依赖性。,非营养性物质（1）抗生素 细胞培养中，特别是原代细胞培养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。（2

13、）pH缓冲剂 最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，常用浓度26mmol/L，接近血中浓度，必须与510CO2平衡，否则培养基迅速变碱。HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。,（3）酚红 酚红普遍作为培养基的pH指示剂（4）保护剂 细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物质。在生物反应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、Pluronic F68、血清白蛋白，能够减轻这种损伤。,（5）还原剂 某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。巯基乙醇在杂交瘤细胞培养

14、中能刺激抗体分泌，并促进半胱氨酸利用。,（6）血清 常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是极其复杂的混合物，含有食物物质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细胞释放物质、采血中引入的污染物。由于历史原因，商业培养基大都是按添加血清来设计的，使用血清技术也很成熟，尽管使用血清有许多缺点，仍将其作为细胞培养最重要的添加剂普遍采用。,培养物的污染及防止,1、污染途径（1）空气：空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩,2、器材：各种培养器皿3、操作

15、：实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。4、血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。5、组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。,动物细胞的大规模培养,（一）培养环境,1、温度 温度是细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度不同。例如昆虫细胞的 最适温度是25280C，人和哺乳动物细胞的最适温度是370C，细胞代谢强度与温度成正比，超出最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。,2、pH,大规模培养时影响

16、培养液的pH稳定性的主要因素有三种：（1）缓冲液的缓冲能力及种类；（2）对流空间大小；（3）葡萄糖浓度。培养液中正常的缓冲系统是NaHCO3/CO2系统，它是一种弱缓冲系统，其pK为6.1，低于生理学最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的对流空间加入CO2以防止它的丢失及增加羟基离子。,也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒害作用。HEPES生物缓冲剂也曾被加入NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于HEPES的pK为7.0，HEPES被加入后，其缓冲能力为pH6.87.2。但是当HEPES浓度高于25mM时，它对大多数动物细胞都有毒害作用。,动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节培养液中

17、的pH：（1）在培养基中添加NaHCO3作为缓冲剂及通入含CO2的空气进行调节,（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/L HCl进行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌和弱混合，利用NaOH或HCl进行调节时会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动物细胞培养时不太合适。通常通过调节培养基中NaHCO3用量及通气中CO2浓度来控制发酵过程的pH。,3、溶解氧,大规模培养中如何提供足够的氧是非常重要的。通气的目的有两个：一是提供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发酵液处于均匀悬浮状态，有利于传质过程。,（二）培养容器1、多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶都是

18、常用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易放入培养箱内培养。2、滚瓶 也是一种重要的培养容器，培养时放在滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培养。它体积较大，接种后放入温室或专门的培养箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入微载体以增加培养表面积。3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设备。它有各种不同形式，容积可以从1升到几十立方米。,微载体 微载体是指直径在60250m、适合于动物细胞贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多好处：可在反应器中提供大的比表面积可采用均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，提高了培养系统的重演性可用普通显微镜观察细胞在微载体上的生长情况容易

19、放大适合于多种贴壁依赖性细胞培养容易收获细胞。微载体培养系统的缺点是：细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长微载体价格较贵，一般不能重复使用需要较高的细胞接种量。,悬浮培养,悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养与微生物过程比较接近，但由于动物细胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，在反应器的设计和操作上又有特殊要求，如利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程中的剪切作用，并通过表面充气及诱导表面气泡产生具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧传递速率。,目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑

20、料袋增殖器、填充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气升式反应器等。,4、细胞大规模培养生物反应器,气升式生物反应器 气升式生物反应器与其它反应器相比，结构简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了污染的机会；产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小；直接通气供氧，氧传递速率高，供氧充分；液体循环量大，细胞和营养成分混合均匀。存在问题：由于液体混合的能量唯一来自通入的气体，因而通气量大，泡沫多，而且气泡破碎造成严重的细胞机械损伤。,通气搅拌生物反应器,根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器转动时混合性能好，产生的

21、剪切力小，气泡产生的不利影响小。设计有多种形式的搅拌器，应用最多的是笼式搅拌器。,笼式搅拌器有两个由200目不锈钢丝网围成的笼式腔。下部是通气腔，上部的是消泡腔，之间有细管相通。气体交换在通气腔内进行，其中的液体通过丝网与腔外的液体进行交换。在气体鼓泡中形成的泡沫经细管进入消泡腔，经丝网破碎分成气液两部分，既做到深层通气，又避免泡沫在反应器中积累。,搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空腔相通，当导流筒随搅拌器转动时，由于离心力的作用，搅拌器中心的空腔产生负压，使培养基从底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再从三个导流筒排出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬浮细胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于培养基，被

22、培养基所裹胁，反复循环，充分混合。在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般搅拌转速在3060r/min范围内。,中空纤维生物反应器 用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时纤维管内灌流充以氧气的无血清培养液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来供细胞生长；对于血清等大分子营养物，划必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜渗入管内

23、，避免了过量代谢物对细胞的毒害作用。,优点占地空间少；细胞产量高，细胞密度可达109数量级；生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。,5、细胞生物反应器的控制系统,由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全而有效地方法是靠通入培养罐内气体中的氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的目的；采用二氧化碳/碳酸氢钠缓冲液系统来控制培养液的pH值，它主要是靠预先加入培养液中适量的碳酸氢钠和通过改变气体流量中的二氧化碳含量来实现。,6、生物反应器中的细胞培养模式,分批培养 分批培养是指将细胞和培养基一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一

24、定时间反应后，将整个反应系取出。,流加培养 流加培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢。到反应终止时，取出整个反应系。,半连续培养 半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，在按分批培养的方式进操作。这是反应器内培养液体积保持不变的操作方式。,连续培养 连续培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，反应条件处

25、于一种恒定状态。与分批培养和半连续培养不同，连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定。因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。,灌注培养,灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。当高密度培养动物细胞时必需保持给细胞补充足够的营养以及去除有毒的代谢废物。通过调节灌注速率可以把培养过程保持在稳定的、废物代谢低于抑制水平的状态下。一般在分批培养中细胞密度为（2 4）106cell/ml，在灌注系统中可达到（25）107cell/ml。,灌注培养优点,1、细胞所处环境中营

26、养条件较好，有害代谢废物浓度低；2、明显提高细胞密度，从而提高产物表达量；3、产物在反应器中停留时间短，防止变性损失；4、培养基的比消耗率降低，生产成本明显降低。,7、培养基研究进展无血清培养基 通常动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源、不同批号蛋白含量差异大及价格高等，给生物制品的生产造成了不利。这就引发了人们对无血清培养基的研究。结果发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等，不少细胞即能在无血清供应的情况下生长，尤其是CHO、杂交瘤及重组骨髓瘤细胞等。

27、,其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长的最重要的多肽。CHO细胞能在仅含重组人胰岛素一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代。在人类细胞培养中，应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。另外，动物细胞培养应用无血清培养基的成功，还将为某些疫苗的生产降低成本。,高等哺乳动物细胞的生长特性,正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：,锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂,血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长,接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制,形态依赖性：细胞称扁平状，并

28、有长纤维网状结构,上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。,高等哺乳动物受体细胞的条件,细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，,遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存,合适的标记 便于转化株的筛选和维持,生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制,便于大规模培养,大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。,安全性能好 不合成分泌致

29、病物质，不致癌,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型的哺乳动物受体细胞,5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）,次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）,次黄嘌呤核苷（HR）,GMP,AMP,尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）,胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）,胸腺嘧啶核苷（TR）,嘌呤核苷酸生物合成途径,嘧啶核苷酸生物合成途径,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶,（HPRT）,（TK）,胸腺嘧啶核苷激酶,氨基喋呤（AP）,氨基喋呤（AP）,从头合成途径,补救合成途径,重新合成途径,补救途径,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型的哺乳动物受体细胞,含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）不能在含有次

30、黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。,含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补。,常用的高等哺乳动物受体细胞,迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO/dhFr-），其优势有如下几个方面：,遗传背景清楚，生理代谢稳定,与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确,基因转移和载体表达系统完善,耐受剪切力，便于大规模培养,被美

31、国FDA确认为安全的基因工程受体细胞,磷酸钙共沉淀法,将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37保温4-16小时此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞；弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化效率。,电击转化法,将待转化的DNA溶解在受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。电击转化法常用

32、于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。,脂质体介导法,将待转化的DNA溶液与磷脂混合，在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa细胞。,哺乳动物细胞的物理转化法,利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。,哺乳动物细胞的病

33、毒转染法,以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因扩增高效表达外源基因,哺乳动物细胞内的基因扩增现象 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加

34、相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。,哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理,通过强化基因扩增高效表达外源基因,DHFR-MTX高效表达系统,外源基因,dhfr,转染dhfr-细胞系,单克隆,0.05 mM MTX,培养,5 mM MTX,0.25 mM MTX,外源基因扩增至100拷贝,培养,单克隆,转移,单克隆,单克隆,培养,培养,转移,转移,不含核苷,GS-MSX高效表达系统,谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。先将带有GS编

35、码基因的载体转入培养的哺乳动物细胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-MTX系统优越之处。,通过强化基因转录高效表达外源基因,mRNA前体,AAAAAAAAA,mRNA,在载体上安装病毒或细胞来源的强启动子以及有效的翻译元件，也是使外源基因高效表达的一种手段，如：细胞巨化病毒CMV的启动子动物珠蛋白基因的内含子SV40的终止子和polyA化信号序列 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪切能促进成熟mRNA向胞质

36、的运输，有利于翻译。有的还含有各种信号肽序列。,利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体,Neor,鼠金属硫蛋白启动子,b 肌动蛋白启动子,抗体轻链cDNA,b 肌动蛋白终止子,pL,dhfr,SV40启动子,b 肌动蛋白启动子,抗体重链cDNA,b 肌动蛋白终止子,pH,大多数恶性淋巴瘤细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath 用人源化的小鼠抗campath抗体治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效果良好。重组抗体采用DHFR-MTX系统表达。,利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂,第一个由重组哺乳动物,dhfr,启动子,人tPA cDNA,终止子,细胞规模化生产的医用蛋白,是治疗急性心

37、肌梗塞的溶血,栓药物：人组织纤溶酶原激,活剂（tPA）。同样采用,DHFR-MTX系统表达，受体,细胞选用CHO系统。目前，,用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。,信号肽编码序列,此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。,利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII,凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIII制品进行治疗。然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。早在上述情况发生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鉴

38、定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA相似，人凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代血友病人的大量需求。,转基因动物的研究,运用将DNA导入细胞的技术，结合从细胞中分离出细胞核并移植到去核卵母细胞中的核移植方法，把单个有功能的基因或基因簇插入到动物的染色体中，并在其中表达，这种转入了外源基因的动物称为转基因动物。,动物克隆技术-Dolly,转基因克隆动物技术-Polly 以动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等）为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体进行动物克隆,组织工程 应用细胞生物学和工程学的原理和方法，用少量组织细胞通过体外培养扩增，构建新的组织和器官，最终在人体实现无损伤修复和真正意义上的功能重建。,“人耳”是由人工亲手植入老鼠体内的：先用一种高分子化学材料聚羟基乙酸做成“人耳”的模型支架，然后让细胞在这个支架上繁殖生长，支架最后会自己降解消失；将裸鼠的背上割开一个口子，然后将已经培养好的“人耳”植入后缝合，“人耳”便与老鼠浑然成为一体。,思考题1、名词解释：转化细胞系、微载体培养2、简述动物细胞的培养特性。3、什么是灌流式操作，其特点 是什么？,