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1、第三章 分子生态学,王 根 轩电话：86971083，E-Mail:,内容,1 分子生态学的产生与发展2 分子生态学的理论基础3 分子生态学的研究方法4 前沿进展举例,2-1:分子生态学的产生与发展一、分子生态学与生命科学,生态系统的三个层次：以个体为基础的宏观生态系统 以细胞为基础的微生态学统 以核酸分子和其他生物活性分子为基础的分子生态系统分子生态学（Burk,1994)：是分子生物学与生态学融合而成的新的生物学分枝学科。而不仅只是应用分子生物学技术研究生态学问题。向近敏等（2000）：应当是研究生物活性分子在其显示与生命关联的活动中所牵连到的分子环境问题。其定义有两层含义：1、运用现代分

2、子生物学技术研究传统生态学问题；2、生物活性分子表现其生命活动时的分子生态条件的规律性。,10-9 10-6 10-3 1 103 106 109,Scale(m),生理学,细胞学,分子生物学,生态学,分 子 生 态 学,尺 度 与 学 科 的 关 系 示 意 图,分子生态学的多学科交叉特性,分子生物学,多学科交叉的复合学科：,群体遗传学,行为生物学,进化生物学,古地学/古气候学,保护生物学,分子进化,系统发生学,数学,生物地理学,生态学,古生物学,分子生态学,Model of DNA built by Watson and Francis Crick at Cambridge Univers

3、ity,1953.,分子生物学与生态学紧密联系：基因研究首先从生物的生态特征和适应入手。,An overview depicting several of the most important early discoveries on the nature of the gene.,二、分子生态学的起源,1950s:凝胶电泳技术（Smithies,1955)和蛋白质组织化学染色方法（Hunter 热稳定DNA聚合酶（Saiki et al.1985,1988).1992:The Journal of“Molecular Ecology”.,2-2:分子生态学的理论基础,一 分子进化的中性理论（

4、neutral theory of molecular evolution):1、理论核心：分子水平上的绝大多数突变是选择上中性的，因而他们在进化中的命运是随机漂变的，而不是由自然选择决定的。2、中性理论对种内遗传变异的解释：分子水平上的绝大部分种内遗传变异（即遗传多态现象）是选择上中型的，突变速率和遗传漂变速率决定遗传多态性的变化速率。中性突变与自然选择的辨证统一：少量突变的非中性。中性理论在分子生态中的应用：排除假设的基础。种群遗传进化：选择、突变、随机遗传漂变、迁移、自然灾害、社会结构等。,二、Hardy-Weinberg principle,内涵：在满足下列假设的条件下，生物种群的等位

5、基因频率和基因型频率保持不变（1）有性繁殖并随机交配；（2）等位基因在雌雄两性中随机交配；（3）种群足够大；（4）世代不重叠；（5）没有自然选择、突变和迁移。分子生态意义：作为基本判别假设和理论基础。,三 种群分化是生物进化的必要途径,1、种群分化的结果：新种形成 种群的杂合度降低2、Wrights F统计方法，F近似地代表等位基因被固定的可能性，又称固定系数。亚种群相对于整个种群的近交系数：FST=(HT-HS)/HT 个体相对于所属亚种群的近交系数：FIS=(HS-HI)/HS个体相对于整个种群的近交系数：FIT=(HT-HI)/HT HI,HS,HT 分别表示个体、亚种群和种群的平均杂合

6、度；(1-FIS)(1-FST)=(1-FIT),四 随机遗传漂变是种群进化的重要动力,小种群比大种群发生漂变的速度快，所以等位基因在小种群中被固定的平均时间比大种群短。一个等位基因被固定的概率等于其此时在种群中的频率，所以稀有基因更易被淘汰。随机遗传漂变降低种群的遗传多样性。因为新突变被固定的概率等于其此时在种群中的频率，所以，新突变在小种群中被固定的可能性大于在大种群中。在metapopulation中，局部种群越小其遗传多样性丧失的越快，局部种群间的遗传分化就越大。对所有中性等位基因的作用一致，因此，在没有其它进化动力的条件下，不同的中性位点揭示的进化（演化）规律应相同。,五 朔祖理论（

7、Coalecent theory),Hudson(1990):,朔祖过程,演化分支过程,假定种群在个世代保持数目恒定，即每个等位基因有N个拷贝，则种群中任一对基因a在t时代以前的概率为：p=(1-1/N)t-1/N 单倍体朔祖时间N，二倍体为 2N,六 分子系统发生分析,分子系统发生（异中求同）分析的基本原则：（1）分子标记的中性原则；（2）进化速率恒定原则，符合“分子钟”假设；（3）分子标记在研究类群中直向同源（4）分子标记具有适当的遗传变异度,六 分子系统发生分析,1 距离法 依据每对单元间的进化距离建立进化树；2 简约法 最大简约法：对于分子数据，该方法计算在最少的碱基替换条件下能够解释

8、整个进化过程的拓扑结构（系统进化树）。3 最大似然法：对观察数据符合每种拓扑结构的可能性进行最大化计算，可能性最大的拓扑结构被选为终解进化树。4 贝斯法：检验观测数据与理论假设的偏离是否大到否定假设的程度，或者现有数据是否足以支持作出有关结论（Shoemaker et al.1998).,2-3 分子生态学的研究方法,1、突变体的筛选与使用。2、分子标记（蛋白质，DNA）线粒体DNA标记 叶绿体DNA标记 细胞核DNA标记（单拷贝DNA，核糖体DNA,微卫星和小卫星，AFLP,RAPD）3、遗传变异检测 序列分析 片段分析,一、突变体的筛选与使用,突变体的筛选与使用在重要生态功能的分子基础（分

9、子生态学）研究中发挥着重要作用，并被欧美一流的学者首选。,诱导突变,一定生态条件下筛选,基因定位和测序,得到基因突变与生态功能的关系,已有的突变材料,生态功能对比研究,得到基因突变与生态功能的关系,二、分子标记,蛋白质标记系统：同工酶分析DNA标记系统,1、线粒体DNA标记,优点：（1）母性遗传，无重组；（2）容易设计保守性通用引物；（3）有效单倍性，即细胞中各线粒体的DNA拷贝的遗传组成等同。（4）哺乳动物线粒体DNA的进化速率约为核DNA的10倍（植物的进化速率很低且基因重组频繁）；缺点：不少物种的核基因组存在与线粒体DNA同源的线粒体假基因，干扰线粒体DNA标记的使用。,2、叶绿体DNA

10、标记,优点：（1）大部分为母性遗传；（2）进化速率小，适合种以上水平的系统发生研究缺点：不太适合种内遗传变异的研究；由于存在一些父性遗传和双亲遗传的情况，其有效单倍性需要具体分析。,3、单拷贝核DNA标记,单拷贝核DNA：核基因组中拷贝数为1的DNA序列（scnDNA)；优点：对运用朔祖理论进行进化谱系分析非常重要且十分有效；缺点：（1）目前通用的scnDNA 标记较少，不得不为每一研究对象建立一套scnDNA标记；（2）二倍体或多倍体杂合性的存在，使单倍型分析很困难；（3）基因重组的广泛存在，使数据分析难度增加。,4、核糖体(r)DNA标记,rDNA标记的优点：（1）重复序列拷贝数服从协同进

11、化规律，因而表现出有效单倍性；（2）由编码区和非编码区嵌合存在，可以根据保守性强的编码区设计通用引物；缺点：（1）变异速率低，种内变异研究的价值因种而异；（2）需要检验符合协同进化规律的程度，因为有例外。*协同进化Concerted evolution:The process by which a series of nucleotide sequences or different members of a gene family remain similar or identical through time.Coevolution:Evolutionary changes in one

12、or more species in response to changes in othre species in the same community.,5、微卫星和小卫星DNA标记,微卫星DNA：重复单位 16个核苷酸；如：（GT)n 优点：主要表现为拷贝数n的变化，便于分析，应用日广。小卫星DNA：重复单位 6个核苷酸,通常1030核苷酸；标记长度大，基因型自动分析不方便，使用频率在下降。,5、微卫星和小卫星DNA标记,1、多位点微卫星指纹分析法：,总核DNA,微卫星DNA探针,杂交,遗传变异检测,缺点：1、对DNA的质量和数量要求较高；2、难以对数据进行深度进化遗传学分析。,5、微卫

13、星和小卫星DNA标记,2、基于PCR的多位点微卫星分析法,核DNA样品,合成微卫星序列引物,PCR,电泳，对比条带差异,优点：简单易行；缺点：隐含不确定性，不宜用于种群遗传进化研究：（1）PCR重复不稳定性；（2）带型有效性（3）条带同源性。,5、微卫星和小卫星DNA标记,3、位点特异性微卫星分析法：,微卫星重复序列区,非重复特异序列区,根据特异序列设计引物,PCR,DNA,电泳,6、AFLP标记,AFLP：Amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性。Zabeau Marc&Vos Pieter(1993)创立。,总核DNA,双链人工接头,

14、连接,特异标记引物,PCR,限制性片段差异,优：需DNA量少；多态性丰富；重复性好；缺：对样品DNA质量要求高；多态片段中有共显性表达现象。,7、RAPD标记,RAPD：Random amplified polymorphic DNA,随机扩增DNA多态性,10bp寡核苷酸随机单引物,核DNA,PCR,电泳分离,优：1技术通用，一套引物可用于不同物种；2简单高效快速；3 需样量少；缺：重复性差，对实验条件极敏感；有假阳性和假阴性结果；显性标记，不能提供完整的遗传信息。,1995年新出现的基因表达序列分析法(SAGE)：,特点：利用特定内切酶，从每个mRNA中切下9-13bp的标签 能够几乎同时

15、分析整个基因组的各个基因的表达频度,最先用于研究癌细胞基因组的表达模式(Velculescu et al.1995,Science)，但此方法为研究多基因控制性状的分子基础提供了方便,三、遗传变异检测,1、序列分析（Sequence analysis)；（1）含系统全面的遗传信息；（2）确切的共祖信息；（3）序列差异标准较统一。（4）缺点：成本较高。,三、遗传变异检测,2、片段分析（Fragment analysis):(1）长度分析：如GeneScan.(2)SSCP分析：单链构象多态性（Single-stand conformation polymorphism)分析.在非变性条件下，单链

16、DNA分子可以形成不同的构象，不同构象的DNA分子有不同的电泳迁移率。可以用电泳检测。最适范围：200400bp.(3)DGGE(Denaturing gradient gel electropgoresis)通常使用化学变性剂（尿素、甲酰胺等）梯度(4)TGGE(Temperarure gradient gel electrophoresis)（5）DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography).利用异源双链与同源双链对介质有不同亲和力的原理。,2-4 前沿进展举例：,研究举例1：单配偶制 和婚外交配行为(extrapair

17、copulation，EPCs),单配偶制是雌雄两性个体彼此占有，这种独占或是直接的，或是通过控制资源而实现的。鸟类以一雌一雄制较普遍，只有少数是例外（Mock and Fujika1990）。目前应用分子标记的方法研究表明：许多单配偶制的鸟类中非配偶对的雌雄个体发生交配关系是一种很普便的现象，（Birkhead 1987。Westneat et al。1990）这就是所谓的婚外交配行为(extrapair copulation，EPCs),研究方法：,在以往的研究中有用观察法判断EPCs现象的，但这种方法受限很大，因为EPCs行为常常非常隐蔽并且短暂，不易观察。后来有利用附跖长和翅长的遗传特

18、性判断EPCs现象的、也有利用羽色多态性和同功酶来研究的。近年来由于DNA指纹技术的应用，使得EPCs现象从分子水平上得到了确认。DNA指纹研究发现小型雀形目鸟类中的EPCs现象尤其显著。,如白领姬鹟、靛蓝彩啄、白冠带鸥等，有2040的后代是EPCs的结果。在对芦鸥的研究中发现93(3334)的雌鸟至少产生过1只EPCs后代。该鸟是一种地面营巢、双亲共同抚育雏鸟、两性异形的小型雀类，在一个繁殖季中EPCs雏鸟比例高达55。,雌鸟控制假说(Female Control Hypothesis),雌鸟控制假说(Female Control Hypothesis)认为EPCs产生后代并不是雄鸟强迫进行

19、交配的结果。许多研究都表明，雌鸟的行为对控制交配成功具有重要意义，雌鸟必须与雄鸟相配合才能保证EPCs受精成功。例如在对双色树燕的研究中已证实雌鸟能控制EPCs和EPCs受精机率，该种群中约有一半的雌鸟有EPCs行为。,雌鸟为什么要进行EPCs呢?,性选择理论认为雌性选择雄性是为了获得资源或是为下一代获得优秀基因。在单配制的种类中，雌性个体与非配偶雄性交配住往不能获得资源上的好处，但这些有EPCs行为的鸟类的后代在基因型上表现有多配特征，有人称之为“遗传一雄多雌制”一般认为单配制鸟类中的EPCs现象是为了从优秀的雄性个体那里获得优良基因或是为了提高精子竞争强度。由于单配制中EPC现象的存在，致

20、使单配制的雄性个体亦受到性选择压力。,举例2 基因多效性：植物水分利用效率和开花时间之间的遗传相关性,J.K.MCKAY,*J.H.RICHARDSand T.MITCHELL-OLDS 2003 Genetics of drought adaptation in Arabidopsis thaliana:I.Pleiotropy contributes to genetic correlations among ecological traits.Molecular Ecology 12,11371151Josette Masle1,Scott R.Gilmore1&Graham D.Far

21、quhar1 2005.The ERECTA gene regulates plant transpirationefficiency in Arabidopsis.Nature 2005，436：866-970,Fig.1 Variation and covariation in flowering time and 13C among natural populations of Arabidopsis thaliana.(Upper)Genotype means of 39 accessions.(Lower)Individual values of the replicates.Bot

22、h panels are shown to indicate the overall patterns of genetic(upper)and phenotypic(lower)(co)variance(see Results).,Fig.2 Effects of FRI and FLC genotypes in two genetic backgrounds on flowering time and 13C(bars are 95%CI).See Table 3 for description of genotypes of the near isogenic lines.(Upper)

23、The phenotype of NILs in a Landsberg erecta background,where the effect of the late flowering FRI allele depends on the genotype at the FLC locus(Michaels&Amasino 2000).(Lower)The phenotypic effect of the FRI allele in the Columbia background.Both panels are at the same scale,demonstrating a greater

24、 increase on both traits in the Ler background.,Figure 1|ERECTA,a transpiration efficiency gene.a,A QTL for D on Arabidopsis chromosome 2(48.9651.02 cM).Simple(black symbols)and composite(red symbols)interval mapping.The dotted line indicates 1%LOD significance level.b,Erecta mutations cause increas

25、ed D.Error bars denote s.e.m.c Conversion of morphological phenotype of Coler2,Coler105 and Ler(left,middle and right panels,respectively)by complementation with ERECTA.Left to right in each set of photographs:ER ecotype;erecta mutant;complemented TERer1 line.Scale bar,75mm(rosettes),180mm(mature pl

26、ants),30mm(pods).d,e,Mutant complementation restores wild-type D and transpiration efficiency values(data are mean s.e.m.).Nature 2005，436：866-970,Figure 3|Leaf anatomical features contributing to the effects of ERECTA on transpiration efficiency.a,Stomatal densities(means s.e.m.;adaxial epidermis).

27、b,Relationship between stomatal conductance and stomatal density.Open symbols,Ter2(squares),Ter105(triangles)and Ler(diamonds);filled symbols,complemented lines.c,Coordinated effects of ERECTA on epidermal cell size and stomatal densities(data for adaxial epidermis,same pair of lines as for a with c

28、ontours of cells outlined to facilitate comparison;scale bar,155mm).d,Stomatal index was unchanged.e,Cross-sections of leaves showing reduced mesophyll development andincreased intercellular spaces in erecta leaves.Scale bar,150mm.,Figure 4|ERECTA improved transpiration efficiency under both wellwat

29、ered and drought conditions.a,Response of instantaneous leaf transpiration efficiency to leaf-to-air vapour pressure difference for Ter105(open squares)and TERer105(black squares)or Col-0(red squares).Vapour pressure difference was varied by changing the humidity of air entering the chamber,keeping

30、leaf temperature constant.Lines were fitted by nonlinear regression;ER plants had greater transpiration efficiency along the whole vapour pressure difference range.b,Whole-plant water use efficiency(days 1630)for well-watered plants or those under drought conditions(labelled w or d,respectively on t

31、he x axis).Blue shades indicate erecta mutants(Ter105,Ter2 and Ler);red shades indicate complemented TER lines and Col-0.Error bars indicate s.e.m.,Summary,1 分子生态学尚处于发展初期，其理论和方法主要建立在已有的分子生物学、群体遗传学和生态学理论和方法基础，有待于发展确立自己学科基础的理论框架；2 分子生态学已在行为生态、种群生态、环境适应和频危机制等领域显示出巨大的优势，解决传统方法很难解决的问题；3 随着GeneBank资料的累积和技术的进步，涉及到多样本大规模分析的分子生态研究将有更大的发展。,思考讨论题,1 分子生态学方法在解决生物的适应与进化等重大问题上有何优势？2 分子生态学的发展对整个生命科学的学科建设有何影响？3 学科交叉是新生还是消亡？,