《分子标记技术》PPT课件.ppt
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1、分子标记技术,Molecular Marker Technology,分子标记技术课程安排,一、分子标记技术概述(3)二、DNA的提取、PCR优化与克隆(3)三、显性分子标记技术(ISSR、AFLP)(6)四、共显性分子标记技术(RFLP、SSR)(6)五、分子标记数据的读取方法与分析(3)六、序列测定与分析(3)文献讨论(6-12),周延清(编著).2005.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.北京:化学工业出版社 郑成木主编.2003.植物分子标记原理与方法.长沙:湖南科学技术出版社 邹喻苹,葛颂,王晓东等.2001.系统与进化植物学中的分子标记.北京:科学出版社 Caetano-Ano
2、lles G&Gresshoff P M(eds).1998.DNA Markers:Protocols,Applications,and Overviews.New York:Wiley-Vch Press.王中仁.1996.植物等位酶分析.北京:科学出版社,参 考 资 料,一、分子标记技术概述,遗传标记(genetic markers),形态标记(morphological markers)细胞学标记(cytological markers)生物化学标记(biochemical markers)分子标记(molecular markers),形态标记,Color:yellow vs whi
3、te etcTexture:smooth vs rough etcShape:round vs irregular etc,遗传标记原用于遗传作图,确定染色体上基因顺序(gene mapping)1913年,Alfred H.Sturtevant 使用六个形态标记构建了第一个果蝇遗传图谱 1923年,Karl Sex发现菜豆数量性状(种子颜色和大小)和数量性状位点之间的遗传连锁(QTL),细胞学标记,核型分析(karyotype analysis),染色体显带(chromosome banding),生物化学标记,同工酶(isozyme):电泳所可区分的同一种酶(系统)的不同变化,等位酶(al
4、lozyme):由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型,其功能相同但氨基酸序列不同,分子标记,或蛋白质序列(大小)(狭义的)指基于DNA分子序列的标记,(广义的)指可遗传的、且可检测到的DNA序列,是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记,分子标记是能反映生物个体或种群间基因组中某些差异特征的DNA片段,分子标记(molecular marker)技术产生的原因:(形态性状的局限)基于形态的遗传标记(形态标记)发展到同工酶又到DNA分子标记 DNA分子标记在分子生物学的发展过程中诞生和发展,它能够直接反映基因组DNA间的差异,*DNA或cDNA等分子水平上的多态性检测技术*能提供分子
5、标记的分子生物学技术,分子标记技术,First Generation:1980s-Based on DNA-DNA hybridizations,such as RFLP.Second Generation:1990s-Based on PCR:Using random primers:RAPD,DAF,ISSR.Using specific primers:SSR,SCAR,STS-Based on PCR and restriction cutting:AFLP,CAPs.Third Generation:recently-Based on DNA point mutations(SNP)
6、,can be detected by SSCP,DNA chip,sequencing etc.酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,CAP),Molecular Markers Classes,1974年,Grozdicker等人首创了DNA分子标记,即第一代DNA分子标记:限制性片段长度多态性标记(RFLP)1982年,Hamande发现了第二代DNA分子标记:简单序列重复标记(SSR)1990年,Williams和Welsh等发现了随机扩增多态性DNA标记(RAPD)1993年,Zebeau和Vos发明了扩增片段长度多态性标记
7、(AFLP)1994年,Zeitkiewicz等等发明了简单重复见序列标签(ISSR)1998年,第三代DNA分子标记SNP诞生 随后,大量的分子标记技术被发展了起来,宏观,微观,个体,分子标记的特点,对理想的遗传标记的要求:具有高的多态性 共显性遗传(鉴别二倍体中杂合和纯合基因型)能够明确辨别等位基因 分布于整个基因组中 选择中性(即无基因多效性)检测手段简单快速(如实验程序易自动化)开发成本和使用成本尽量低廉 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换),DNA分子标记的特点,直接以DNA的形式表现,在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到不受季节、环境限制,不存在表达与否等问题数量极多
8、,遍布整个基因组,可检测的基因座位几乎是无限的多态性极高,自然界存在许多等位变异,无需人为创造表现为中性,不影响目标形状的表达许多标记表现为共显性的特点,能区别纯合体和杂合体,DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现 基于DNA分子标记的分子标记技术大致可分为五大类,分子标记技术的类型,1)以Southern杂交为基础的分子标记技术 限制性内切酶片断长度多态性标记(restriction fragment length polymorphism,RFLP)单链构象多态性RFLP(sing strand conformation polymorphism-RFLP,SSCP-RFLP)变性梯度凝胶
9、电泳RFLP(denaturing gradient gel electrophoresis-RFLP,DDGCE-RFLP)原位杂交(in situ hybridization),RFLP原理示意图,DNA 的提取,基因组DNA的酶解,琼脂糖凝胶电泳,数据分析,Southern印迹转移,标记探针杂交,放射自显影,2)以PCR为基础的分子标记,随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)序列标记位点(sequence tagged site,STS)序列特征化扩增区域(sequence characterized amplified r
10、egion,SCAR)技术 随机引物PCR(random primer-PCR,RP-PCR)任意引物PCR(arbitrary primer-PCR,AP-PCR)寡核苷酸引物PCR(oligo primer-PCR,OP-PCR)单链构象多态性PCR(single strand conformation polymorphism-PCR,SSCP-PCR),什么是STSs:即序列位置标签(Sequence Tagged Site)是指一小段DNA片段(200500个碱基对),它的精确位置和碱基顺序已经明确的。由于每个STS都是唯一的,一对唯一的PCR引物对应一个STS,通过PCR反应中也可
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