《分子杂交技术》PPT课件.ppt
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1、A,C,G,T,分子杂交技术,基因公司技术讲座,*分 子 杂 交*,分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子(探针)的一门技术。,分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图,样 品 制 备,电 泳,杂 交,转 膜,结果显示,探 针 制 备,*分 子 杂 交 分 类*,Southern Blot-DNA杂交,Northern Blot-RNA杂交,Western Blot-蛋白质杂交,原 位 杂 交,*样 品 制 备*,DNA 纯 化,RNA 纯 化,*探 针 制 备*,随机引物法合成高特异活性的DNA探针NEBLotKit,特 点:*活性高:109 dpm/ug*标记效率高:可用于5
2、ng-2 ug的模板DNA量,模板量,用 途,基因文库筛选Southern 杂交Northern 杂交原位杂交,随机引物法双链DNA探针合成标记优化技术 DECAprimeTMII Random Priming DNA Labeling Kit,优化技术:*高纯度无外切酶活性的 Klenow酶提高了标记效率 10分钟完成反应*改进的标记动力学增加了探针产量 对低纯度及低浓度模板也能通过延长反应时间达到目的*独特的Decamer溶液提高引物-模板复合物稳定性 减少引物双体形成,提高了灵敏度*标记灵活:提供 dATP和 dCTP 两种标记缓冲液,特异性单链DNA探针合成标记优化技术 Prime-A
3、-ProbeTM Strand Specific DNA Probe Synthesis Kit,活 性 大 于 4 cpm/ug,109,合成高特异性全长RNA探针的最佳选择 MAXIscriptTM 体外转录试剂盒,特 点:*可合成长达2kb的RNA*产量可达2-4ug/ul 同位素标记可达109 cpm/ug*对应不同的启动子有不同的试剂盒可供选择*同位素或非放标记均可,多次洗脱反复杂交探针制备技术 Strip-EZTM System,专门为需要在同一张膜上反复标记检测不同信号的用户设计,提供非常温和的杂交信号洗脱条件,提高膜的使用寿命达通常的三倍左右。,工 作 原 理合成探针的同时掺入
4、经过修饰的dNTP(修饰不影响杂交特性)杂交检测后将膜浸入探针降解缓冲液中将探针降解68温和洗脱适用于:NorthernSoutherndot/slot及相关杂交,Strip-EZTMRNA探针合成Strip-EZTMRNA Probe Synthesis&Removal Kit,特 点:*灵敏度高 比随机引物法DNA探针灵敏10倍以上*温和洗脱,提高膜寿命*不同启动子有不同试剂盒*同位素和非放标记均可,效 果 比 较,PCR 法Strip-EZTMDNA探针的合成Strip-EZTM PCR Stripable DNA Probe Synthesis&Removal Kit,特 点:*模板多
5、样:克隆序列、cDNA、PCR产物*不对称PCR技术,产物大多为单链DNA探针*灵敏度高,比随机引物法高3-5倍*提供除模板、标记物、Taq 酶外所有合成探针 及洗膜试剂,包括M13正反向及T7引物,结 果 比 较,cDNA,dsDNA,ssDNA,ssRNA,Oligonucleotide,ssRNAssDNAdsDNAOligonucleotide,Probe Type,*标 记 类 型*,放射性同位素标记:灵敏度高,成本低 但操作不便,标记效率不太稳定,寿命受半衰 期限制 非放射性标记(地高辛、生物素、荧光素等):安全,标记稳定,探针寿命较长 但灵敏度较低,背景较高,成本高,非 放 射
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