《分子克隆技术》PPT课件.ppt

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1、分子克隆技术,分子克隆（molecular cloning）又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术,克隆（Clone）指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。,分子克隆 指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合-重组DNA分子（重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达，即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。,基本原理：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将重组质粒转入大肠杆菌，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而克隆

2、基因或表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。,As a result of this work,Paul Berg shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry with Walter Gilbert and Frederick Sanger for fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids,with particular regard to recombinant-DNA.,At Stanford Berg and his colleagues spliced two DNA mole

3、cules together in vitro and were able to insert a set of three genes responsible for metabolizing galactose in Escherichia coli into the SV40 DNA genome.,This work led to the emergence of recombinant DNA technology and provided a major tool for analyzing mammalian gene structure and function.,大肠杆菌转化

4、体系的建立：感受态菌制备经氯化钙处理的大肠杆菌能够摄取质粒DNA。,1.双抗性（TerKar)重组质粒DNA及双抗性转化大肠杆菌细胞的获得。,2.真核动物非洲爪蟾的基因在原核细胞中转录,意义：1.解决了无复制能力的DNA片断在宿主细胞中进行繁殖克隆的关键问题；2.质粒分子可作为基因克隆的载体将外源DNA分子导入宿主细胞；3.真核细胞的基因可被转移到原核细胞中进行克隆及表达。,分子克隆中的关键技术：DNA分子的分离和富集技术；DNA分子的切割与连接技术；载体构建技术；大肠杆菌转化技术；重组DNA分子的筛选和鉴定技术,分子克隆的基本步骤：1.目的基因的获得 2.目的基因与载体的连接 3.重组DNA

5、分子导入受体细胞 4.筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆 5.克隆基因、克隆基因的表达,载体特征：1.能自主复制的复制子2.可供筛选的遗传标记3.适当大小的分子量4.合适的限制性内切酶位点，方便外源基因的插入5.在受体细胞中高效复制,TA克隆的idea最初来自1994年。几位学者发现TaqDNA聚合酶在PCR产物的3末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。之后，invitrogen公司发明了TA克隆技术，并拥有全球TA cloning商标的专利权。线性化的T载体在3末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补。,工具酶,筛选标记 抗生素抗性筛选,蓝白筛选：lacZ基因-半乳糖苷酶 互补,