《凝胶过滤》PPT课件.ppt

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1、第五章 凝胶过滤,是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。又叫分子筛层析凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。,不同类型凝胶的筛孔的大小不同,凝胶过滤基本原理,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快，所以首先流出。相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所以最后流出。,中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子

2、的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。,凝胶过滤层析过程示意图,凝胶过滤的优点：,设备简单操作方便重复性好样品回收率高等特点,适用：,a.分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质b.测定蛋白质的分子量c.样品的浓缩和脱盐等方面,第一节 凝胶的分类及性质,性质：凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分子筛功能。,分类,葡聚糖凝胶（Sephadex）天然琼脂糖（Sepharose、Bio-gel A）交联琼脂糖（Sepharose CL-）

3、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel）交联葡聚糖双丙烯酰胺共聚凝胶（Sephacry1）交联葡聚糖与葡聚糖共价结合的凝胶（Superdex）,一、葡聚糖凝胶,商品名：Sephadex，由葡聚糖（右旋糖酐）（G型）和3-氯-1，2-环氧丙烷（交联剂）以醚链相互交联而成的。在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。,1理化性质,葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见其表面的网状皱纹。含大量羟基，亲水性好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。不同型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，膨胀度、吸水量、筛孔的大小和分组范围有明显的差异。,1）以G型葡聚糖凝胶作为固定相，以水

4、溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。2）以LH型葡聚糖凝胶作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。,2稳定性,葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解。在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可高温（120）消毒30分钟，性质不变。在0.1mol/L HCl 溶液中浸泡1-2小时，在0.02mol/L HCl 溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。,当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷键水解断裂。葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否则，

5、微生物将生长。,3吸附性,葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质）发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无吸附力了。葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作洗脱液。,二、琼脂糖凝胶,琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，在100时呈液态，当温度在45以下时，以氢键方式相互连接成线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，在的缓冲液中是稳定的。,琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典称 Sepharose美国称 Bio-gel

6、 A英国称 Segavac丹麦称 Gelarose我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中除Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。,琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose 2B（2浓度）、4B（4）和6B（6）。Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。,CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1,3-二溴异丙醇（1,3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。优点：其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热稳定性与化学稳定性好可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较强的

7、碱溶液短时间处理，性能不会改变。缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚。,琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。,三、聚丙烯酰胺凝胶,商品名Bio-gel。是以甲叉双丙烯酰胺（双体）作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有Bio-gel P-2到P-300。,一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。特点：不溶于水和普通有机溶剂；能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡；在pH l-10或短

8、时间超过此pH值的溶液中较稳定；要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解（高温条件）。,缺点：对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可以克服。,四、Sephacryl,Sephacryl 由烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。Sephacryl 吸水时，其珠状颗粒直径平均值为70 um。通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。,特点：,a.在所有的溶剂中不溶解，化学降解很少；b.可在pH 2-11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链将发生少许水解作用；在0.2mol/L N

9、aOH 溶液中（室温下）处理100小时，对其低流速和多孔性没有明显影响；c.清洁剂（如SDS）、6mol/L盐酸胍和8 mol/L尿素溶液可作洗脱剂，高温（120）消毒（pH=7时）处理后，层析性质没明显变化。,Sephacryl 能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖（Proteoglycans）。也可用于大的病毒颗粒（直径 300-400 nm）的分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。,第二节 基本原理,凝胶过滤层析的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。它可以完全或部分排阻大分子化合物；而不能排阻小分子化合物，让其在筛孔中自由地扩散、渗透。凝胶层析柱排阻的化合物范围在0

10、-100之间。,洗脱体积（Ve）包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，故其洗脱体积 Ve Vo 对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积 Ve Vt分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。,凝胶过滤的原理,凝胶层析柱洗脱曲线示意图 完全排阻的大分子 中等分子 完全渗透的小分子,分配系数：表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。Vo和Vt可以通过测定得

11、到，测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分配系数。在一定的条件下，Vt和Vo都是恒定值。大分子先从柱中流出Ve值小Kav值小小分子后从柱中流出Ve值大Kav值大,对于完全排阻的大分子 Ve Vo 故 Kav 0 对于完全渗透的小分子 Ve Vt 故 Kav 1Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系：Kav b lgMr+c 由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有：Ve b lgMr+c,通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve

12、 或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过标准曲线即可求出其分子质量。,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关，,LogM,A,B,C,LogM测,V测,先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。,LogM=k1-k2Ve,（Ve为洗脱体积）,影响筛分效果的因素：,1）操作条件：如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等；2）Kav值的差异性。Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，等于1或等于零（即使样品个各组分的分子

13、量相差很大），则分离效果差，或根本不能分开。,第三节 操 作,一、凝胶的选择和处理1凝胶的选样（1）型号凝胶型号很多。型号不同，筛分范围也不同。市售的Sephadex的分离范围，常用高聚糖或球蛋白测定。Sephadex G型适宜于分离蛋白质。若用于分离核酸，则受其空间结构和所带基团的影响，选用高于它们分子量范围的型号，或者选用适当型号的生物胶和Sephacryl。,在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶Sephadex G-25。当溶液通过G-25柱时，蛋白质被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类扩散到凝胶网孔里后流出来。这样蛋白质就得到纯化。一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分子量差别越大，

14、分离的效果越好。,（2）粒度,凝胶的粒度有粗有细（与交联度无关）。细颗粒凝胶之间空间小、装柱易均一，分离效果好（与粗颗粒凝胶相比），但流速慢，采用大直径的层析柱。可用于小型试验，能得到满意结果。粗颗粒凝胶流速快，宜用小直径的层析柱，如操作得当，可得到较满意的结果。,2凝胶用量的计算,根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，可计算出所需干凝胶的用量：干凝胶用量（g）=r2 h/膨胀度（床体积/克干胶）用此法计算出的干凝胶用量还需增加 10%-20，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失。,3凝胶的处理,将干凝胶倾入5-10倍的蒸馏水中，根据凝胶溶胀所需的时间充分浸泡，除去表面悬浮的小颗粒，再用0.5mol

15、/L NaOH-0.5mol NaCl 溶液在室温下浸泡30min，抽滤除去碱液，用蒸馏水洗至中性，浸泡于蒸馏水和平衡液中抽气，除去凝胶颗粒中空隙中的气泡，或采用加热煮沸法，不仅去除气泡，还能加快凝胶的溶胀，但必须避免在酸或碱溶液中加热。,二、凝胶柱的制备,1.柱的选择直接影响分离效果当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高；当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱分离两种以上的物质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高。理想的层析柱的直径与长度之比是1:25-1:100。层析柱最好有夹套，可控制温度，重复性好。,2装柱,装

16、柱的具体操作与要求按吸附柱层析的装柱方法进行。,装柱,1）装柱前，用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。2）先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。,3凝胶柱的鉴定,将蓝色葡聚糖-2000，或红色葡聚糖或细胞色素C或血红蛋白等配成2毫克/毫升的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的、柱中没有裂缝和气泡，否则重新装柱。如鉴定时采用的是蛋白质类物质

17、，有两个作用：1）鉴定柱子；2）克服柱子对某些分离物的不可逆吸附作用。,三、加样与洗脱,1加样 加样量与测定方法和层析柱大小有关。测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少。否则反之。加样量掌握得当，可提高分离效果。,一般来说，加样量越少，或加样体积越小（样品浓度高时），分辨率越高。当用于样品的制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前提下增大。究竟加样体积多少为宜？这要视被分离物在层析柱的分配系数（Kav）或洗脱体积（Ve）来决定。,分离效果与加样体积、被分离样品在层析柱中的洗脱体积或分配系数，以及凝胶床的体积有关。为了提高分离效果，在一定范围内，加样体积越小越好。例如，在蛋白质溶液中脱盐

18、时，因加样量过大会产生分离不完全的现象。而加样量减少时，则产生良好的分离效果。,样品的粘度也影响层析的分辨率。样品的粘度大（11.8)比小的分辨率低。一般样品粘度以小于2，或与洗脱液的粘度相当为宜。,2洗脱,所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则。一般都以单一缓冲液（如磷酸缓冲液、Tris-HCl 缓冲液等），或者盐溶液作为洗脱液。也可用蒸馏水作洗脱液。,洗脱时的流速要严格控制。否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定。控制流速的最好装置：恒流泵（微量泵），它可以使流速恒定，还可以使其在较大范围内选择。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。大多数实验室采用此种方法控制流速。,洗脱

19、流速慢，分离效果就好，但是太慢时也会因扩散加剧而降低分离效果。加样后，经洗脱收集到的每管洗脱液，可选用适当的方法进行定性和定量测定。,四、凝胶柱的再生和保存,1.再生 仅使用一次的凝胶柱，可重新平衡后再使用。用过多次后，由于凝胶床体积变小，流动速度降低或污染杂质过多，使其正常性能受到影响。再生方法是：先用水反复进行逆向冲洗。再用缓冲液进行平衡，即可重复使用；另一种方法是：把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用。,2保存,使用过的凝胶柱，若短时间保存，则需反复洗涤除去蛋白质等杂质，加入适当的防霉剂；若长时间保存，则将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。其方法

20、：将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡后，再用水反复洗涤，过滤抽干，并浸泡在浓度稍高的乙醇溶液中。,如此依次提高乙醇浓度进行反复处理，待乙醇浓度增加至95时，将凝胶抽干。置60烘箱中烘干，可装瓶保存。溶胀的凝胶不能直接用高温烘烤，否则会粘结成块（机械捣碎会破坏珠状结构）。交联度越小的葡聚糖凝胶，越难以脱水。一般可采用将其较长时间浸泡在的60-70乙醇溶液脱水。,五、凝胶过滤层析经常遇见的问题,1流速慢 1）有气泡、出水管阻塞；2）没打开夹子；3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气）。2柱内产生气泡 1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流；2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧。,3条带扭曲 1）胶面不平；2）样品或洗脱液中有颗粒；3）装柱不均匀。4分辨率不高 1）装柱不均匀；2）样品量过大；3）流速太快；4）柱不垂直或柱不合适。,5.长菌 6.柱下口软管太长7.胶不适当,