《凝胶电泳》PPT课件.ppt
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1、第二节 基因操作的主要技术原理,凝胶电泳扩增原理分子杂交DNA测序生物芯片,一、凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,同时也是分子生物学研究方法的技术基础。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳,1、基本原理,带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链,依靠无反应活性的稳定的介质(琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液,在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异,以及所带电荷的不同,可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。,DNA的迁移速率决定因素,1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数
2、近似成反比;2 琼脂糖浓度 浓度越低,相同核酸分子迁移越快;3 DNA的构象 一般同一分子:超螺旋环状线状切口环状。,4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭(EB)插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。5 所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6 琼脂糖种类 常见的有两种:标准琼脂糖和低熔点琼脂糖;,凝胶电泳的分辨力:与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间,Separation Range Vs.%Agarose,Low Geling Agarose,不同类型琼脂糖的性质,Agarose Gel El
3、ectrophoresis 琼脂糖(agarose)是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷,2、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。,D-半乳糖,3,6-脱水-L-半乳糖,琼脂糖凝胶的特点,(一)优点1.因不含硫酸根和羧基,几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微,故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀,孔径较大,可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。4.透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性,(二)缺点1.机械强
4、度差,易破碎,浓度不能太低。2.易被细菌污染,不易保存,临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散,电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比,分子筛作用小,区带少。,分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP)琼脂糖。(1)LMP琼脂糖 熔点:6265 熔解后,在37可保持液态数小时;在25可保持液态约10min回收DNA操作:将凝胶在65下加热数分钟,再向液态琼脂糖中加入过量酚液抽提DNA,经离心获得含DNA分子的上清液,酶切DNA片段后电泳。,(2)琼脂糖凝胶电泳的参数:,缓冲液:1 TAE(TBE TPE)凝胶的含量:根据检测的DNA大小 加DNA样品:1g,指示剂溴酚蓝 电泳条件:大片断低
5、电压长时间,小片段高电压短时间(5V/cm),(2)琼脂糖凝胶电泳的参数:,染色和观察:溴化乙锭(ethidium bromide,EB)染色,在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪),能看到0.05 g的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比,操作,预染色的标本,用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算,Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8%Agarose,1,2,4,6,8,10,12,kb,Agarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit:5-10 ng DNA,Agarose gel electrop
6、horesis,Agarose gel electrophoresis,【注意事项】,1.琼脂糖融化时,档位不宜太高。2.制胶和加样过程中要防止气泡的产生。3.EB具有强诱变性,可致癌。必须戴手套操作,严格注意防护。4.加样时,Tip头不宜插入样品孔太深,也不要穿破胶孔壁,否则样品渗漏或DNA带型不整齐。5.电源接通时,应核实凝胶的方向是否正确。6.电泳仪有电压显示,并不一定标志电泳槽已接通,应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍,表示电泳已开始。7.溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中,在紫外光的照射下,插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光,所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位
7、置。,3、聚丙烯酰胺凝胶电泳,Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE-,原理,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂N,N,N,N四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethyl ethylenedia mine,简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate(NH4)2S2O8,简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结
8、构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)。,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,原理,聚丙烯酰胺凝胶三维结构,聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。用途:放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。,2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。注:迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途:制备高纯度的DNA片段。,(三)DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的
9、浓度为丙烯酰胺的1/30;,Home,图.1 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽7.冷凝系统,图.2 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板3.短玻璃板 4.凹形橡胶框,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的原理:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS),则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定
10、蛋白质分子量。,3、聚丙烯酰胺凝胶电泳,Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE缓冲液:TBE凝胶聚丙烯酰胺电泳:丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺(29:1);TEMED(四甲基乙二胺,加速剂)过硫酸铵(10,催化剂)。,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头,大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照
11、片,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,PAGE 的 特 点,1.具有分子筛效应,分辨率高2.样品不易扩散,用量少,灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定,分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷,消除了电渗现象5.机械强度好,有弹性,在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节,4、脉冲电场凝胶电泳(PFGE),1984年,发明的。分离超大分子量的DNA分子。在脉冲电泳中,电场方向是周期变化的,头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 度角,下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 度角。,脉冲电场电泳示意图,脉冲场凝胶电泳原理图,北,南,脉冲场电泳 常规电泳 两组电极,排列不均
12、匀;一组电极,电场方向不变,电极排列均匀,定时改变电场方向,DNA分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈45o,在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备DNA 程中,电压有时可随时间的增加而样品增加,制备DNA样品与常规方法不同,4、脉冲电场凝胶电泳(PFGE),由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向,来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比,分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位,使之能够按新的方向游动,所以迁移率就慢,从而达到了分离大分子量DNA分子的目
13、的。,PFGE can resolve large DNA fragments,类型,垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field)场翻转系统(field inversion)旋转胶系统(rotating gel)箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field)动态调控闭合均一电场电泳,垂直交变电场系统,场翻转系统,箝位匀强电场系统,旋转胶系统,影响分辨率的因素,1 脉冲时间(0.1s-1000s):增加脉冲时间分离较大分子,减少脉冲时间分离较小分子。2 电压:若固定脉冲时间,增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围,但
14、是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。,3 电场夹角:电场方向的夹角常为1100-1200,研究证实900夹角也非常有效的。4 温度:标准琼脂糖电泳基本在室温进行,PFGE一般应在4 进行。较高的温度DNA泳动较快;但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。,种类 1)按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖)2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶 3)两种方法比较:分离效果和分离范围;操作难易 2.用途 琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析;聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序 制胶 点样 电泳 染色
15、 观察DNA电泳 1.DNA分子种类 1)线状DNA单链与双链,ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA,造成迁移距离不确定 2)环状DNA单链(如M13mp)和双链(质粒DNA)3)线状ds-DNA电泳使用频率最高的一种电泳,这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响:i.分子量 的大小:迁移距离与分子量的常用对数成反比 ii.凝胶浓度:浓度越高,移动距离越短,适合分离低分子量DNA浓度越低,移动距离越长,适合分离高分子量DNA,iii.电压:低电压时,迁移率与电压成正比;电压增高时,不同大小DNA片段迁移率增大是不同的。iv.碱基组成与温度:不受影响,温度高可导致DN
16、A带变形或解链。,4)环状ds-DNA电泳:常用于质粒DNA的初步鉴定5)线状ss-DNA电泳 链分离凝胶:化学定序时,用于单链分离。DNA双链互补,但组成不一样,仍可分离(机理不详),电泳时形成三条带:变性双链,两条单链。,核酸定序凝胶(染料指示剂):为避免局部区域产生二级结构,可采用各种变性措施,如煮沸样品,提高电泳温度,凝胶中加入变性剂(尿素、甲醛、甲胺等),RNA凝胶电泳 方法:不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构,而且在整个电泳过程中也保持一级结构。1.乙二醛/二甲基亚砜法 原理:乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应,
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