《凝胶层析原理》PPT课件.ppt

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1、小 结,层 析CHROMATOGRAPHY,一、概述,1、定义 层析(又名色谱)一种利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。,分子极性分子大小分子形状离子亲和力分子亲和力吸附能力,2、物理化学性质间的差异,层析分析法的基本原理：,样本分子依其分子极性选择亲和两相之一,吸附层析,分配层析,Liquid-Solid,Liquid-Liquid,两相系统,A,B,C,每次分离样本都要做一次选择,One Plate ofSeparation,(理论板数),极性,非极性,极性,非极性,1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱

2、分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;,3、层析的发展,1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代 色谱分析的建立1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC),1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC

3、)仪1975年，Small等提出离子色谱 20世纪80年代，超临界色谱20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Ress第一次电泳实验）21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展,层析法进行时有两个相，一个相称为固定相，另一相称为流动相。,支持物,含待分离物质,气相层析,液相层析,气-固 气-液,液-固 液-液,二.层析技术的分类,1.按两相所处的状态分类,以气体作为流动相,以液体作为流动相,2.按层析的机制可分为,吸附层析adsorption chromatography 分配层析partition chromatography 凝胶层析gel chromatography

4、亲和层析affinity chromatography离子交换层析 ion-exchange chromatography,定义 指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物分离的方法,原理 在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用物理作用的范德华吸附：无选择性，吸附速度快，吸附的过程是可逆的化学吸附：由原子价力的作用引起。有选择性，吸附速度较慢，不易解吸,（1）吸附层析,在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸,吸附层析,常用的吸附剂,硅胶,碱性:碳氢化合物 中性

5、:醛,酮,醌,酯,内酯酸性:酸性色素,醛,酸,聚酰胺,氧化铝,活性炭,磷酸钙,粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱,锦纶66或锦纶6 酰胺基团 对酚,DNP-氨基酸,醌,羧酸 氢键：羟基与羰基,唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石,（2）分配层析,利用不同组分在流动相和固定相中的分配系数不同而进行分离的方法。,柱层析colum chromatography 进样量大且容易回收薄层层析thin layper chromatography 小量样品，快速，操作简便,3.按制备量分类,层析法的演变过程：,圆形滤纸,长条滤纸,薄层层析(TLC),柱层析,容量变大,容量更

6、大,加展开液,纸层析,薄层层析,三.层析的一般原理,1.分配系数Partition coefficient 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）中分配程度,溶质在固定相中的浓度 CsK=溶质在流动相中的浓度 Cm,特定的温度：常数K大：被固定相吸附的牢固，随流动相 的移动速度较慢。,纯化生物物质的纯度 取决于混合物中各组分K 值的差异程度 混合物中各组分若 K值相差较大,则能较易地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质分离,凝胶层析Gel Chromatography,凝胶过滤（gel filtration）(Porath,Flodin,1959)分子筛层

7、析（molecular sieve chromatography）(Hjertn,Mosbach,1962)排阻层析（exclusion chromatography）(Pedersen,1962)指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。,一、基本原理,固定相（凝胶）,三维空间网状结构,A good gel for gel filtration contains about95%water,凝胶层析法：,分子筛效应：分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。,凝胶层析过程的数理关系,1、柱床体积(VT)V

8、T=1/4 D2h 2、洗脱体积（Ve）即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。3、外水体积（V0）即存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。4、内水体积（Vi）即凝胶颗粒内部所含水相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。5、凝胶干体积（Vg）,柱床体积VT,凝胶干体积Vg内水体积Vi,存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。,颗粒内部所含水相的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量相减求得。,凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。VT=1/4 D2h,外水体积V0,VT=Vg+V0+Vi,数理关系,Ve Vo Kd=V

9、i,6、分配系数（Kd）：,特点：（1）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关（2）与柱的长短粗细无关,每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（Kd）,Ve=Vo+KdVi,(2)Ve=Vo+Vi Kd=1分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1,最后流出.,(1)Ve=Vo Kd=0分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里,最先流出。,(3)0 Kd 1 Ve=Vo+ViKd为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散,三.凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定 2.操作条件较温和。3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化,四、

10、凝胶层析的缺点1.要求样品和洗脱液的粘度很低 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用,五、凝胶的结构与性能,1.葡聚糖凝胶1959年Porath和Flodin合成（商品名为Sephadex）（1）结构：基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构,（2）特点：,交联度：交联剂越多 交联度越大 网孔结构越紧密交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松,化学性质：稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂,耐热耐碱不耐强酸,（2）特点：,Sephadex

11、的分级范围 G10 700G15 1,500G25 1,000-5,000G-50 1,500-30,000G-75 3,000-70,000G100 4,000-150,000G150 5,000-400,000G200 5,000-800,000,吸水性G类的型号表示每克干凝胶吸水量（ml）x10如G-50 每克干凝胶吸水量为5ml,大孔凝胶工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限可分离MW40万以上的物质可用来分离核酸及病毒。,2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose),3.聚丙烯酰胺凝胶,各种层析胶体：,Pharmacia,SephadexSepharoseSephacrylSe

12、phacel,glucoseagaroseglucose+acrylamidecellulose,六.其它条件选择,1.柱的选择 柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象,2.样品的选择：量适当,粘度小 3.洗脱液的选择：每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据使样品稳定的原则使用,七、应用,1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量,Elution volume(ml),Albumin,NaCl,Desalting in a simple column,测分子量,对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量(MW)大小顺序流出,MW大的走在前面,V

13、e与MW的关系可用下式表示:Ve=K1-K2lgMWK1,K2 为常数,MW为分子量,实验：凝胶层析法分离蛋白质,血红蛋白 64,480二硝基苯-鱼精蛋白 2,000-12,000Sephadex G-50 孔径 1,500-30,000,一、原理：,Kd=0,Kd=1,1、装柱 先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积 凝胶不能有气泡和分层现象 装柱结束后要保持凝胶表面平整,二、操作注意点：,凝胶柱的装填方法：,装填胶体,暂停流洗,X,继续流洗,已堆积,沉淀中,上清,紧密堆积,检查好管柱是否畅通,12,Gel,继续流洗,2、加样使液面和凝胶表面相切，关闭出口 加样时尽量不要破坏凝胶面 让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱,血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱体积？,三、结果要求：,