《光学显微术》PPT课件.ppt

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1、Orlando Science Center March 2003,光学显微术,显微镜主要光学部件构造相差显微镜原理和使用荧光显微镜原理和使用,Orlando Science Center March 2003,一、显微镜主要光学部件构造,Orlando Science Center March 2003,被检物AB放在物镜(O1)下方的一倍焦距之间，则在物镜(O1)后方形成一个倒立得放大实像，这个实像正好位于目镜(O2)的下焦点之内，通过目镜后形成一个放大的虚像 A2B2，这个虚像通过调焦装置使其落在眼睛明视距处，即 25cm，使所看到的物体最清晰，也就是虚像A2B2 是在眼睛晶状体的两倍焦

2、距之外，在眼球后的视网膜形成一个倒立的 A2B2 缩小像A3B3。,显微镜的光学原理,Orlando Science Center March 2003,1.物镜（Objective）,Orlando Science Center March 2003,1.1物镜的光学性质,放大倍数：与透镜的焦距成反比，与光学筒长成正比 光学筒长（160mm）放大倍数 焦距,Orlando Science Center March 2003,工作距离：物镜下透镜的下表面与载片物像的距离。物镜放大倍数愈大，工作距离愈小,在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，

3、各物镜的镜口率如下表：物镜 镜口率(N.A.)工作距离(mm)10 0.25 5.40 40 0.65 0.39 100 1.30 0.11,Orlando Science Center March 2003,数值口径（NA）：其大小与显微镜的分辨率有关。NAsin/2焦深：物镜视野中能清晰观察到物像 的垂直范围。一般随物镜放大 倍数增加而减小。,Orlando Science Center March 2003,3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。光学显微镜的分辨力 R=0.61/NA其中为入射光线波长；NA为镜口率 sin/2；n=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角）,Orlan

4、do Science Center March 2003,几种介质的折射率,Orlando Science Center March 2003,显微镜的几个光学特点：介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好；sin/2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.5；普通光线的波长为400700nm，光镜分辨力约为0.2m，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,色 差,系白色光经透镜后各单色光焦点不一致的现象,一般可用一个含钙的

5、双凸透镜和外包两个含铅的单凸透镜组成的消色差透镜校正,Orlando Science Center March 2003,球面像差,系入射透镜中部和边缘部分的光线折射后在不同的点上聚焦而产生，可用含多组透镜的消错透镜来校正。,Orlando Science Center March 2003,像散：系透镜在成像过程中使物像在水平 或垂直轴面上产生分散的现象。慧形像差：系透镜在成像过程中产生慧形 拖尾的现象。像场弯曲：系透镜在成像过程中发生的像 场弯曲的现象。畸变：系透镜在成像过程中产生畸形像场 的现象。,Orlando Science Center March 2003,1.2 物镜的种类,消

6、色差物镜:代号A或Ach，能消除红蓝两种 色光的色差，并校正黄绿色光的球面像差。复色差物镜：代号Apo，能消除红、绿、蓝 三种色光的色差和红、绿两种色光的球面 像差。半复消色差物镜：代号SemiApo，性能 介于以上两种物镜之间，价格居中的物镜。,Orlando Science Center March 2003,平场与超平场物镜：代号Plan与Splan，系经特 殊设计和加工完全消除了球面像差和其它像 差的高级物镜。其它专用物镜：如供像差、荧光、偏光和微分干 涉等特殊显微观察用的物镜。可调节的物镜：包括可随盖玻片厚度变化调节的 高倍物镜和带有缓冲弹簧的油镜和高倍镜。,Orlando Scie

7、nce Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,2.目镜,2.1 作用：放大，投射，补光校正。250mm（明视距离）放大倍数 焦距（mm）1000物镜NA值最适目镜放大倍数 物镜的放大倍数,Orlando Science Center March 2003,2.2 构造：包括标准接目透镜、会聚 透镜和光阑三部分2.3 类型,惠更斯目镜：代号H，亦称负目镜。两个平凸透镜均按 凸面向下排列，其光阑为中空的圆形光阑。雷姆斯登目镜：代号R，亦称正目镜。两个平凸透镜的 凸面相对排列，光阑在下透镜之下。,Orlando Science Cen

8、ter March 2003,Orlando Science Center March 2003,补偿目镜：代号K，系由四组透镜组成专为复消色差物镜配套，能进一步消除色差和像差的专用目镜。,Orlando Science Center March 2003,平场目镜：代号P,系视野内物像清晰度较高的目镜，尤其适用于显微摄影。广视野目镜：代号WF，系视野大而平的高级目镜。,Orlando Science Center March 2003,3.聚光器：由23个或更多的凸透镜组成，下部为孔径光阑。,Orlando Science Center March 2003,3.1 类型,阿贝式聚光器消色差

9、平周聚光器暗视野聚光器：1.中部透光型2.抛物面型3.心型4.上部摇动式,Orlando Science Center March 2003,3.2 使用方法,聚光器的镜口率要与物镜相匹配 物镜的NA值聚光器的NA值物镜的有效镜口率 2,Orlando Science Center March 2003,应尽量使聚光器保持在最上位置，可通过调节孔径光阑来调节NA值，通过调节光源亮度来调节入射光强度。使用NA值1.0的聚光器时，可在聚光器上，透镜与载片之间加香柏油。关小孔径光阑时，一般能加大物像反差，但降低了分辨率。,Orlando Science Center March 2003,4.光源和

10、照明方法,4.1 类型分离式光源：可调变压器，灯箱,内置整体式光源：灯泡、透镜、滤色镜、视野光阑,Orlando Science Center March 2003,二、相差显微镜原理和使用,Orlando Science Center March 2003,相差显微镜（phase contrast microscope）一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。1942年制造了第一台相差显微镜，由于此发明，泽尔尼克于1953年获诺贝尔奖。,相差显微镜,Orlando Science Center March 2003,普通光学显微镜只能观察能使入射光在色

11、调和光强度方面发生变化的标本物像。对于未染色的活细胞标本，由于细胞成分间的色调和透光率变化很小而难于观察。荷兰的Zernike在上世纪40年代发明了能将入射光经活体物像后产生的光相位差转换为明暗反差的相差显微术，并于1953年获得诺贝尔物理奖。,Orlando Science Center March 2003,原理,人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，未经染色的标本（如活的细胞），其形态和内部结构往往难以分辨。显微镜中所观察的许多物体，如生物切片、油膜和位相光栅等，均具有较高的透明度。光波通过这些物体时，只改变入射光波的位相而不改变它的振幅，这种物体称为“位

12、相物体”。,Orlando Science Center March 2003,Brightfield Phase contrast,Orlando Science Center March 2003,相差法,由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。位相（相位）：任一时刻光的振动状态,（振幅相同的光不同时刻振动状态不同，光是余弦函数变化的）光程：光在媒质中通过的路程和该媒质折射率的乘积。将光在介质中传播的路程折合为光在真空中传播的相应路程。,Orlando Science Ce

13、nter March 2003,人的眼睛只在光的波长(颜色)和振幅(亮度)变化时能观察到被检的物体，而活细胞或末经染色标本多为无色透明，当光波被通过时，其波长和振幅并没发生什么变化，所以无法辨认。为了观察活细胞的显微结构，就需要使用相差显微镜。,Orlando Science Center March 2003,相差显微镜与普通显微镜主要不同之处在于用环状光栏代替可变光栏，用带相板(phase plate)的物镜(通常用“ph”标志)代替普通物镜，并带有一个合轴调中望远镜及滤色片。这些特殊装置能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，

14、把相差变成振幅(明暗)之差，使人的肉眼能够辨认出来。,Orlando Science Center March 2003,构造（特殊光学装置）,a.环状光阑（Ring slit/annular diaphragm）:位于光源与聚光器之间。作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体-相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。,Orlando Science Center March 2003,b.相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的

15、相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,1.A+相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。2.B+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。,Orlando Science Center March 2003,b.相位板（Phase plate）:装在物镜的后焦平面处两部分：1共轭面：半透明的环状，保障未发生偏斜的直射光通过。将直射光推迟一定波长，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差 2补偿面：保障衍射光通过。并将

16、衍射光推迟一定波长，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。有相板的物镜称”相衬物镜”，外壳上常有”Ph”字样。,Orlando Science Center March 2003,C.合轴调节望远镜:使环状光阑的像与相板共轭面完全吻合，实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。D.绿色滤光

17、片 由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。,Orlando Science Center March 2003,示意图,Specimen:样本Objective:物镜Condenser:聚光镜Deflected light:相板（Phase ring）环状光阑（Annular ring),Orlando Science Center March 2003,相差的产生,光通过透明物体时是要慢下来的，为了把直接传播的光和被物体衍射的光区分开来，在聚光器的焦平面上放一环形光栅，并在两个物镜

18、之间插入一个相板，使相板上的环形条纹与环形光栅的象恰好重（通过合轴调节望远镜）。这样，直射光全部穿过位相板上的环纹（共轭面），而衍射光多半穿过纹道的外部（补偿面）。,Orlando Science Center March 2003,振幅差的产生,两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。,Orlando Science Center March 2003,应用,相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、

19、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Review-interference of light waves with same wavelength,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Scien

20、ce Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,2.装置,1.1 相差物镜：内置有相板，可区分为直射光区和衍射光区两部分，分别用阻光物质（如薄的金属镀膜）减小光亮度。若经处理后直射光的相位与衍射光相同，则为正相差，反之则为负相差。1.2 环状光阑，其大小应与相差物镜放大倍数相匹配。1.3 合轴调整望远镜：用于观察并调节环状光阑的亮环

21、与相差物镜的暗环相匹配。1.4 黄绿色滤光片，将白色或偏色光改为单色光。,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,3.使用方法,1.依次将物镜换为相差物镜，聚光器换为相聚光器，并升至最高位置，并在视场光阑处加上黄绿色滤光片。2.将活体标本放在镜台上，把相聚光器调至10处，用10相差物镜观察并调节至物像清晰。3.将目镜换成合轴调整望远镜，把上透镜适当旋出并调节使相板上的亮环与暗环准确聚焦。4.调节相聚光器两侧的调节旋钮（或插入式调节杆），使亮环准确的与暗环重合。,Orlando Science Cen

22、ter March 2003,5.将合轴调整望远镜重新换为目镜进行低倍镜观察，并将物像调至视野中部。6.依次按3.23.5的步骤进行20，40物镜和100油镜观察。7.注意事项：a.一定要将聚光器升至最高位置。b.相差物镜与相聚光器一定要匹配，否则无法使亮环与暗环重合。c.视野亮度应随物镜倍数升高而加大。,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Back focal plane,Front focal plane,Proper al

23、ignment of condenser annulus and phase plate are essential for phase microscopy,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Limitations of Phase Contrast,Poor for thick samples for two reasons：,Poor lateral(z)resolution due to limited apertur

24、eSufficiently thick samples can shift light more than 1 wavelength(so thin and thick sections can have similar brightness for biological samples thicker than about 10 microns),Orlando Science Center March 2003,三、荧光显微镜原理和使用,Orlando Science Center March 2003,荧光显微镜 Fluorescence microscope,特点：光源为短波光；有两个

25、特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Fluorescence image,DNA in blue and Microtubules in green,用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,Orlando Science Center March 2003,标本物像内部的荧光物质或经荧光染料染色的标本经紫外光短波光激发后能发出一定波长的荧光，上述标本可以用荧光显微镜观察。常用的生物细胞内部的荧光物质主要有荧光素和绿色荧光蛋白等。

26、荧光染料主要有金胺0、吖啶橙R、异硫氰酸荧光黄、罗丹明B和荧光抗体等。,Orlando Science Center March 2003,荧光显微镜的类型和构造,1.透射式荧光显微镜 让紫外等激发光从下经聚光器会聚后照射在标本上，并在物镜上方的光通路上加滤光片阻挡紫外等激发光而仅让荧光通过，到目镜进一步放大成像。,Orlando Science Center March 2003,2.落射式荧光显微镜 让紫外等激发光经过物镜从上而下照射标本，并同时接收从标本发出的荧光，再经物镜上部的阻挡滤光片滤除激发光，只让荧光照射到目镜放大成像。,Orlando Science Center March

27、2003,Orlando Science Center March 2003,只需在普通光学显微镜增加以下附件即可进行显微荧光观察。,Orlando Science Center March 2003,1.紫外光源：一般为100W高压汞灯，配有专用变压器。使用 时应尽量减少起闭次数。2.分色镜：用于选择入射激发光波长，一般有UV（紫外）、V（紫色光）、B（蓝色光）和G（绿色光）等不同的分色滤光 片。3.阻挡滤光片：用于阻挡紫外光而只让激发的荧光通过，使用 时应根据激发荧光的波长从多个滤光片中选择。4.荧光物镜：透镜一般用能让紫外光透过的氟石或石英磨制，代号为FL或UVFL。5.聚光器：使用透射

28、式荧光显微镜时，应装上特制的能让紫外 光透过的聚光器。6.无荧光硅油：进行油镜观察时，不能用普通光学显微术的香 柏油，只能用无荧光的硅油。7.保护罩：位于物镜转换器上部，能保护观察者不受紫外光的 照射。,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March

29、 2003,Orlando Science Center March 2003,Orlando Science Center March 2003,荧光显微镜的使用方法与注意事项,以日本Olympus Vanox AHB-LB 型反射式荧光显微镜为例。,Orlando Science Center March 2003,1.开启电源转换器上主开关后，再按下启动钮将汞灯点 燃。2.先用普通光将待检样品在10物镜下聚焦，根据检测 对象的激射和荧光性质选择适合的激射光与分色片组 合。3.关闭普通光，移动汞灯光路控制拉杆使紫外光射出，适当调节汞灯视场光阑，使之在视野中可见，再适当 缩小孔径光阑使物像反差适当。观察完毕后将物像移 至中部依2、3介绍的方法作20、40物镜观察。4.进行油镜观察时，应采用无荧光硅油，并在载片样面 上部和聚光器上部（使用透射式荧光显微镜时）均滴 上硅油。,Orlando Science Center March 2003,注意事项：,（1）因样面激发产生的荧光长随连续照射时间加长而减弱，因此进行荧光观察时需要及时更换视野，以保持较强的荧光物像。（2）汞灯应在观察时间内始终开启，点燃后15分钟内不得关闭，关闭后3分钟以内不得再启动，否则将降低使用寿命。（3）更换新汞灯后应按厂家说明书要求，重新调中后才能使用。,