《RNA的生物合成》PPT课件.ppt

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1、RNA的生物合成RNA Biosynthesis(Transcription),转录(transcription)是生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录,参与转录的物质：,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,转录的模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。转录的这种选择性称为不对称转录(asymmetric transcription)，它有两方面含义：在DNA分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；其二是模板链并非总是在同一单链

2、上。,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录,RNA合成由RNA聚合酶催化,（一）RNA聚合酶能直接启动RNA链的合成,DNA依赖的RNA聚合酶催化

3、合成RNA；RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,RNA,延长的RNA,DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。,（二）原核生物RNA聚合酶由多个亚基组成,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),转录起始阶段,转录延长阶段,真核生物具有3种不同的RNA聚合酶:,RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol）,真核生物的RNA聚合酶,RNA聚合酶和DNA的特殊序列启动子(promoter)结合后，

4、就能启动RNA合成。,RNA聚合酶结合到DNA的启动子上起动转录,转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,调控序列中的启动子是RNA聚合酶结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录，其中由亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法。,RNA聚合酶保护法,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T P

5、u A T A T T A Py,-10 区,RNA-pol辨认位点(recognition site),用RNA聚合酶保护法研究转录起始区,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合:,一个典型的真核生物基因上游序列:,原核生物的转录过程The Process of Transcription in Prokaryote,RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、转录起始需要RNA聚合酶全酶,转录起始需解决两个问题：,2.DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(open transcription complex)；,1.RNA聚合酶全酶(2

6、)与模板结合，形成闭合转录复合体(closed transcription complex)；,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,转录起始过程：,第一个磷酸二酯键生成后，亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于DNA模板上，酶沿DNA链前移，进入延长阶段。,二、原核生物的转录延长时蛋白质的翻译也同时进行,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，

7、NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol（核心酶）DNA RNA,转录延长：,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；转录尚未完成，翻译已在进行。,这种形状说明：,依赖Rho 因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止,三、原核生物转录终止分为依赖(Rho)因子与非依赖因子两大类,转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,依据是否需要蛋白质因子的参与，原

8、核生物转录终止分为：,因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD。因子能结合RNA，又以对poly C的结合力最强。因子还有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。,（一）依赖因子的转录终止,因子：,因子的作用原理：,目前认为，因子终止转录的作用是：与RNA转录产物结合，结合后因子和RNA聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放。,（二）非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,5UUGCAGCCUGACAAA

9、UCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,近终止区的转录产物形成发夹(hairpin)结构是非依赖因子终止的普遍现象。,茎环结构使转录终止的机理：,使RNA聚合酶变构，转录停顿；

10、使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,真核生物的转录过程The Process of Transcription in Eukaryote,真核生物的转录过程比原核复杂。二者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。,一、真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶,真核生物具有3种不同的RNA聚合酶:,RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol）,真核生物的RNA聚合酶,真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂，所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基.RNA聚合酶由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。RNA聚合酶最大亚基

11、的羧基末端有一段共有序列(consensus sequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminal domain,CTD)。CTD对于维持细胞的活性是必需的。,二、转录起始需要启动子、RNA聚合酶和转录因子的参与,（一）转录起始前的上游区段具有启动子核心序列,不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA序列，但这些序列都可统称为顺式作用元件(cis-acting element)。,一个典型的真核生物基因上游序列:,顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件(upstream promo

12、ter elements)或promoter-proximal elements)等近端调控元件和增强子(enhancer)等远隔序列。起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hognest盒或TATA盒(TATA box)。通常认为这就是启动子的核心序列。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,（二）转录起始前复合物,真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物(

13、pre-initiation complex,PIC)。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors,TF)。,（三）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录,为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子

14、。拼板理论(piecing theory)：少数几个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA聚合酶结合，但有时也可直接与基本转录因子、RNA聚合酶结合。,三、真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。RNA-pol前移处处都遇上核小体。转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移

15、位,转录方向,四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行,真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相关的。真核生物mRNA有聚腺苷酸(poly A)尾巴结构，是转录后才加进去的。转录不是在poly A的位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿。已发现，在读码框架的下游，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点。,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,转录终止,和转录后修饰密切相关。,真核生物的转录终

16、止及加尾修饰,复制和转录的区别,真核生物RNA的加工Post-transcriptional Modification of Eukaryotic RNA,真核生物转录生成的RNA分子是初级RNA转录物(primary RNA transcript)，几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工，才能成为具有功能的成熟的RNA。加工主要在细胞核中进行。,几种主要的修饰方式：,1.剪接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),一、真核生物mRNA的加工包括首、尾修饰和剪接,（一）前体mRNA在5-末端加入“帽”结构,大多数真

17、核mRNA的5-末端有7-甲基鸟嘌呤的帽结构。这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶，加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)催化完成。,帽子结构：,5 pppGp,帽子结构的生成过程：,帽子结构的意义：,可以使mRNA免遭核酸酶的攻击；也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。,地球上两种基本的细胞形式,DNA,原核细胞,真核细胞,（二）前体mRNA在3端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾,尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。poly A的有

18、无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。一般真核生物在胞浆内出现的mRNA，其poly A长度为100至200个核苷酸之间，也有少数例外。前体mRNA分子的断裂和加多聚腺苷酸尾是多步骤过程。,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,转录终止,和转录后修饰密切相关。,维持mRNA作为翻译模板的活性 增加mRNA稳定性,poly A 结构的意义：,外显子(exon)和内含子(intron),外显子：在断裂基因及其初级转

19、录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,（三）mRNA的剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-

20、nuclear RNA,hnRNA)snRNA(small nuclear RNA),snRNP与hnRNA结合成为并接体,snRNP与hnRNA结合成为并接体,具有酶促活性的RNA称为核酶。,核酶(ribozyme),核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。,1989年诺贝尔化学奖,授予了分别独立地发现具有酶活性的RNA分子的美国科罗拉多大学（ColoradoUniversity）的Thomas R.Cech（42岁）和 耶鲁大学（YaleUniversity）的Sidney Altman（50岁）。,Thomas R

21、.Cech Sidney Altman,在研究核糖核酸(RNA)的催化功能时，他们发现RNA也可以有生物催化功能。RNA分子中，不同部位分别扮演催化活性。这一发现，改变了以往认为，使得生物体内各种生化反应得以在室温的环境下完成，都是借助于多种酶分子的催化作用，具有催化活性的酶分子都无例外地是蛋白质的传统概念。开创了核酸化学中的一个新领域。,mRNA的剪切（cleavage）和剪接（splicing）,剪接（splicing）：去除初始转录产物上的内含子，将外显子连接为成熟的RNA。,剪切（cleavage）：去除某些内含子，在上游的外显子3-末端加上 poly A。,选择性剪接（alterna

22、tive splicing）,剪切 剪接,选择性剪接,降钙素基因相关肽,许多真核生物基因转录后有一个对mRNA外显子加工的过程，可通过特定碱基的插入、缺失或置换，使mRNA序列中出现移码突变、错义突变或无义突变，导致mRNA与其DNA模板序列不匹配，使同一前体mRNA翻译出序列、功能不同的蛋白质。这种基因表达的调节方式称为mRNA编辑（mRNA editing）。,RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。,mRNA的编辑(mRNA editing),二、tRNA的转录后加工,tRNA前体,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,三、rRNA的转录后加工,真核生物的RNA聚合酶,