《RNA的合成》PPT课件.ppt

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1、这是位于甘肃省酒泉市阿克塞哈萨克族自治县县城西约50公里红柳沟的柱廊状宫殿式丹霞地貌局部（4月20日摄）。甘肃省酒泉市阿克塞哈萨克族自治县红柳沟的丹霞地貌呈南北走向、全长约6公里，处在阿尔金山主峰脚下，以柱廊、宫殿等形状为主，壮观美丽，堪称鬼斧神工。这段丹霞地貌过去曾长期不被外界了解，2007年经有关丹霞地貌专家考察，确定其为柱廊状宫殿式丹霞地貌。,壮美的南极,第十七章RNA的生物合成,Key Terms,transcriptionRNA polymerasepromoter sitestranscription factorfootprintingconsensus sequencesigm

2、a subunittranscription bubblerho(r)proteinTATA boxenhancer,pre-mRNA5 cappoly(A)tailRNA editingRNA splicingspliceosomesmall nuclear RNA(snRNA)alternative splicingcatalytic RNAself-splicingIII.Synthesizing,RNA的合成过程,包括起始，延伸和终止三个部分（RNA）n+NTP（RNA）n+1+PPi RNA合成需要;双链DNA 活化前提(NTP)镁离子或锰离子 酶类,识别阶段；酶与启动子的结合（全酶

3、）DNA链的 局部打开.转录的起始阶段；DNA摸板和RNA碱基配对RNA链的延长；核心酶向前移动，RNA链延长.转录的终止；酶到达基因转录终点.新合成的RNA 和 RNA 聚合酶从DNA上脱落.,Transcription Is Catalyzed by RNA Polymerase,We begin our consideration of transcription by examining the process in bacteria such as E.coli.RNA polymerase from E.coli is a very large(400 kd)and complex

4、 enzyme consisting of four kinds of subunits.The subunit composition of the entire enzyme,called the holoenzyme,is a 2 b b s.The s subunit helps find a promoter site where transcription begins,participates in the initiation of RNA synthesis,and then dissociates from the rest of the enzyme.RNA polyme

5、rase without this subunit(a 2 b b)is called the core enzyme.The core enzyme contains the catalytic site.This catalytic site resembles that of DNA polymerase in that it includes two metal ions in its active form.One metal ion remains bound to the enzyme,whereas the other appears to come in with the n

6、ucleoside triphosphate and leave with the pyrophosphate.Three conserved aspartate residues of the enzyme participate in binding these metal ions.Note that the overall structures of DNA polymerase and RNA polymerase are quite different;their similar active sites are the products of convergent evoluti

7、on.,一 RNA聚合酶,1960-1961年发现，全酶分子量465000，有五种亚基 组成，含有两个锌原子全酶中无希格码亚基的酶称为核心酶，核心酶只能使已开始的RNA链延长，不具有起始合成RNA的能力希格码亚基称为起始亚基 RNA聚合酶的作用是合成一条与被转录的DNA互补的反平行的RNA链。RNA以53方向合成，而RNA聚合酶沿着模板链35方向移动。,RNA Polymerase Structures.The three-dimensional structures of RNA polymerases from a prokaryote(Thermus aquaticus)and a eu

8、karyote(Saccharoromyces cerevisiae).The two largest subunits for each structureare shown in dark red and dark blue.The similarity of these structures reveals that these enzymes have the sameevolutionary origin and have many mechanistic features in common.,RNA Chains Are Formed de Novo and Grow in th

9、e 5-to-3 Direction,RNA聚合酶的组成,二 真核生物RNA聚合酶,RNA聚合酶 I:存在于核仁,转录 28S,18S,5.8S rRNA.RNA聚合酶II:存在于核质,转录mRNA RNA聚合酶III:存在于核质,转录tRNA和 5SrRNA结构含有8-14个亚基,转录泡,三 摸板链 负链 无意义链 非摸板链 正链 有意义链,DNA Unwinding.RNA polymerase unwinds about 17 base pairs of template DNA.,Transcription Bubble.A schematic representation of a

10、transcription bubble in the elongation of an RNAtranscript.Duplex DNA is unwound at the forward end of RNA polymerase and rewound at its rear end.The RNA-DNAhybrid rotates during elongation.,四 RNA聚合酶与启动子的识别,启动子(Promoter),Prokaryotic Promoter Sequences.A comparison of five sequences from prokaryotic

11、promoters reveals arecurring sequence of TATAAT centered on position-10.The-10 consensus sequence(in red)was deduced from a largenumber of promoter sequences.The sequences are from the(A)lac,(B)gal,and(C)trp operons of E.coli;(D)from lphage;and(E)from F C174 phage.III.Synthesizing,The first nucleoti

12、de(the start site)of a transcribed DNA sequence is denoted as+1 and the second one as+2;thenucleotide preceding the start site is denoted as-1.These designations refer to the coding strand of DNA.Recall that thesequence of the template strand of DNA is the complement of that of the RNA transcript(se

13、e Figure 5.26).In contrast,the coding strand of DNA has the same sequence as that of the RNA transcript except for thymine(T)in place of uracil(U).The coding strand is also known as the sense(+)strand,and the template strand as the antisense(-)strand.,启动子,在RNA合成中用作模板的链称模板链或负（-）链。与模板链互补的DNA链称为非模板链或正（

14、+）链。非模板链与转录的RNA在碱基序列上是一致的，只是DNA中用T代替了U。非模板链有时又称为编码链，它在转录和蛋白质合成中没有直接功能。RNA合成中转录起始点标上+1，这个位点前面的碱基对标以负数，它们是不被转录的，而起始之后的碱基序列标以正数。这里不设0数。5端方向称上游(up stream)3端方向称下游(downstream)根据习惯是指非模板链中的序列。,实验证明，启动子序列中某些核苷酸是保守的，即在大多数情况下它们都会出现，称为共有序列。原核与真核生物启动子通常含有两个共有序列。原核生物共有序列出现在-10和-35所以称-10区和-35区。真核生物共有序列出现在-25和-75，分

15、别称为-25区（TATA box或Hoghess box）和-75区（CAAT box）。紧邻转录起始点的共有序列是一个A/T富含区，它使DNA双链容易局部解链。,五 起 始,1亚基与核心酶结合形成RNA聚合酶全酶。2全酶以静电作用和启动子上游非特异性DNA 结合。3RNA聚合酶全酶沿DNA上下游动，包括共有序列在内与启动子特异性结合，全酶结合后引起DNA片段部分解链伸展开约11bp（从-9+2）4酶与ATP或GTP结合，结合的三磷酸核苷酸形成转录物的5末端，刚结合上的三磷酸核苷3OH与下一个核苷酸生成磷酸酯键。所以真核和原核生物的转录作用以A或G开始。5当全酶继续向下游移动，约有4个核苷酸与

16、ATP（GTP）进行聚合。亚基从全酶上解离，核心酶继续合成。新RNA链生长方向是53，新合成的RNA链与被转录的DNA链互补，反平行。,Sigma Subunits of RNA Polymerase Recognize Promoter Sites,六 RNA链的延长,RNA链的延长是53方向，按碱基互补原则依次连接核苷酸，每秒合成最大速度为50个核苷酸，转录由启动子至终止子RNA聚合酶全酶识别起始位点，合成几个磷酸二酯键，希格玛亚基释出核心酶继续催化，酶沿着DNA摸板3 5移动，前面的DNA双股渐打开，转录过的区域又形成双股DNA。转录中DNA双股中只有一股为摸板链 5端是pppG 或 p

17、ppA 从头合成，第二个核苷酸就与ATP（或GTP）的3-OH形成3，5-磷酸二酯键继而参入RNA链。在参入核苷酸的过程中重复形成3，5-磷酸二酯键构成转录的延长阶段，此阶段RNA链不断延伸。RNA聚合酶后面的DNA恢复双螺旋结构，当到达DNA的一个特殊位点时，转录即停止。RNA聚合酶无校对功能故转录出现的误差是复制的10万倍。由于一个基因的转录产物很多因而可以耐受如此大的误差。,终止包括：停止RNA链的延长 新生RNA链的释放 RNA聚合酶从DNA上释放原核生物的终止子 原核生物的终止子在终止点之前均有一个回文结构，其产生的RNA可形成发卡结构。在终点前还有一系列U,回文对称区通常有一段富含

18、G-C的序列。,七 RNA链的终止,Termination Signal.A termination signal found at the 3 end of an mRNA transcript consists of a seriesof bases that form a stable stem-loop structure and a series of U residues.,大肠杆菌的两类终止子,依赖于rho()终止子；必须在rho()存在下发生终止。此类终止子其回文结构不富含G-C区,回文结构之后也无寡聚U。不依赖于rho()终止子(简单终止子)；此类终止子除能形成发卡结构外，在

19、终点有6个U核苷酸,回文对称去有一段富含G-C序列。rho();分质量为46000的蛋白质，通常以6聚体的形式存在。在有RNA存在时它能水解三磷酸腺苷，rho()可沿RNA链移动。有rho()时合成RNA链短。无rho()时合成RNA链长。,E.coli的转录终止有两种机制,不依赖rho因子的终止机制。在富含A/T的DNA基础上，前段还富含G/C的节段，富含G/C的RNA转录物自身回折形成一种发夹结构。发夹结构的末端还有一连续U碱基序列可与模板链A碱基序列互补，当RNA转录物形成发夹结构，迫使聚合酶暂时停止作用。依赖rho(蛋白)因子的终止机制。在无A/T和G/C富含节段发生的，需rho参加，

20、rho因子是由相同的6个亚基组成的寡聚蛋白质。rho蛋白只有在单链RNA存在的情况下水解ATP与新生单链RNA结合。rho蛋白的ATP酶活性使rho蛋白沿新生RNA链转录泡单方向移动。将RNADNA分开，终止转录。,Effect of rho Protein On the Size of RNA Transcripts.,Mechanism For the Termination of Transcription by r Protein.This protein is an ATP-dependenthelicase that binds the nascent RNA chain and

21、pulls it away from RNA polymerase and the DNA template.,八 RNA生物合成的抑制剂,嘌呤和嘧啶的类似物 人工合成的碱基类似物DNA摸板功能的抑制物 烷化物 放线菌素 嵌入染料 RNA聚合酶的抑制物 利福酶素 利链菌素,九 RNA转录后加工,转录后的RNA最初是以一种完全没有活性的形式存在，称为初级转录物（primarytranscript）。这种初级转录物需要进行转录后加工，使之转变成有活性和成熟的RNA。转录后的加工包含3种共有的分子变化：1从初级转录物上移去核苷酸；2给转录物添加上核苷酸；3转录物中特殊碱基的修饰。,原核生物的rRNA

22、 的加工 真核生物的rRNA 的加工 原核生物的tRNA的加工 原核生物的mRNA的 加工真核生物的mRNA的 加工,核糖体RNA（rRNA）前体和转移RNA（tRNA）前体的加工,1原核生物的rRNA前体沉降系数是30S含有一个拷贝的5S，16S，23S rRNA和几个tRNA前体。2真核生物的rRNA前体沉降系数为3547S，含有一个拷贝的5.8S，18S和28SrRNA。第四个真核rRNA即5SRNA只有一个单独的前体。经RNA酶切割前导序列成为成熟的核糖体RNA。3原核和真核的tRNA的转录过程也是先合成大的前体。大多数真核tRNA前体在反密码子附近有一个内含子，并含有前导序列。经专一

23、的核酸酶连续作用将它们切除，用CCA-OH替代3端UU后而成为成熟的tRNA。,Primary Transcript.Cleavage of this transcript produces 5S,16S,and 23S rRNA molecules and a tRNAmolecule.Spacer regions are shown in yellow.,酵母移去14个核苷酸,前导序列,Transfer RNA Precursor Processing.The conversion of a yeast tRNA precursor into a mature tRNArequires t

24、he removal of a 14-nucleotide intron(yellow),the cleavage of a 5 leader(green),and the removal of UU andthe attachment of CCA at the 3 end(red).In addition,several bases are modified.,核酸酶,核酸酶P是专一的核糖核酸酶。催化大多数tRNA 前提产生分子的5端（切除前导序列形成pG）。由-RNA分子（377核苷酸）和一个蛋白质分子组成，保持完整的酶活性两者都需要。但催化亚基是RNA而不是蛋白质，蛋白质只起保持RNA

25、正确折叠和最大的催化活性。核酸酶P（ribozyme）是一种具有工具酶一样催化活性的核酸。,mRNA的加工,1原核mRNA不进行加工，转录和翻译偶联同时进行。2真核生物mRNA初级转录物要经过剪接外显子、戴帽、多聚腺苷酸化等加工过程。a.外显子剪接 许多真核基因是以不连续基因或割裂基因出现。有些序列戴有遗传信息，为RNA节段编码，称为外显子，有些序列不为RNA编码，但含有某些调控成分，这种插入的序列称为内含子。内含子将一个外显子与另一个外显子分隔开，mRNA前体中存在内含子和外显子的相应序列。加工过程主要是切除内含子后连接外显子。它是由核内小RNA（snRNA）和核内小核糖核糖白（snRNP）

26、聚集形成专一性很差的复合物，称剪接体。剪接体通过自身的snRNA和转录物之间碱基互补来识别剪接位点。,b.mRNA5端戴帽和3端加尾 真核mRNA需要进行两种修饰。在5端加一甲基化帽子和在 3端加上多聚腺苷酸（poly A）尾。转录进行时5末端的修饰作用就立即开始，构成共转录加工加帽反应分四步进行。真核mRNA合成后需要在3-OH端加上一个poly A尾巴。核酸内切酶从mRNA前体的高度保守的AAUAAA切割信号下游1030个核苷酸的位点进行酶切，然后在聚腺苷酸酶催化下加上poly A。poly A可保护mRNA的3-末端不会被核酸酶降解，并有助于mRNA从细胞投向胞浆转移。,Capping

27、the 5 End.Caps at the 5 end of eukaryotic mRNA include 7-methylguanylate(red)attached by a triphosphate linkage to the ribose at the 5 end.None of the riboses are methylated in cap 0,one is methylated in cap 1,and both are methylated in cap 2.,Polyadenylation of a Primary Transcript.A specific endon

28、uclease cleaves the RNA downstream ofAAUAAA.Poly(A)polymerase then adds about 250 adenylate residues.,帽子结构常被甲基化 Cap 0 Cap 1 Cap 2 m7G-5-PPP-5-Nm,帽子的功能使mRNA免遭核酸酶的破坏能使mRNA与核糖体小亚基结合,开始合成 蛋白质被蛋白质合成的起始因子识别,促进蛋白质 合成,绝大多数真核生物mRNA具Poly A尾巴功能mRNA进入细胞质所必须？提高mRNA在细胞质中的稳定性真核生物mRNA的拼接真核生物mRNA的甲基化修饰,cDNA,真核生物mRNA

29、的加工,转录含有外显子和内含子的mRNA的前体（hnRNA）切除内含子5端帽子结构和3端多聚A的结构,RNA Polymerase Structures.The three-dimensional structures of RNA polymerases from a prokaryote(Thermus aquaticus)and a eukaryote(Saccharoromyces cerevisiae).The two largest subunits for each structureare shown in dark red and dark blue.The similarity of these structures reveals that these enzymes have the sameevolutionary origin and have many mechanistic features in common.,