《RNA的转录合成》PPT课件.ppt

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1、第八章 RNA的转录合成,RNA Biosynthesis Transcription,8.1 概述,分子生物学最基本的原理是：基因是唯一能够自主复制、永久存在的遗传单位，其生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使RNA、翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象,8.1 概述,转录（transcription）：指拷贝一条与DNA链序列完全相同（除了TU之外）的RNA单链的过程 基因表达的核心步骤翻译（translation）：指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程 基因表达的最终目的,转

2、录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录,体外两条链均可转录体内仅有一条链转录与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链(coding strand)、+链或称有意义链(sense strand)、Crick链另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的 DNA链称为模板链(template strand)或称-链、反义链(antisense strand)、Watson链,8.1.1 一般特点,8.1.2 真核和原核基因转录的差异,模板识别转录起始通过启动子转录的延伸终止,8.1.3 主要阶段,RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程启动子：基

3、因转录起始所必需的一段DNA序列转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对,模板识别,RNA链上第一个核苷酸键的形成,转录起始,核心酶 DNA RNA,转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入延伸阶段通过启动子的时间代表启动子的强弱，时间越短，该基因转录起始的频率越高,通过启动子,RNA聚合酶离开启动子沿RNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的

4、延伸当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNADNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板链上释放出来，这就是转录的终止,转录的延伸和终止,参与转录的物质,原料:NTP(ATP、UTP、GTP、CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA polymerase，RNA-pol)其他蛋白质因子,复制和转录的区别,8.2 模板和酶 Templates and Enzymes,8.2.1 转录模板,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla V

5、al His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 模板链并非永远在同一条单链上,不对称转录 asymmetric transcription,8.2.2 RNA聚合酶 RNA polymerase,大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),E.coli 中不同的因子,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,识别DNA双链上的启动子使DNA变性在启动子处解旋成单链通过阅读启动子序列，RNA pol确定它自

6、己的转录方向和模板链最后当它达到终止子时，通过识别停止转录,RNA pol 执行多功能,真核生物的RNA聚合酶,3种聚合酶都由2个大亚基、12个以上的小亚基组成在3种聚合酶之间，最大2个亚基、至少5个小亚基的基因编码区具有同源性；4-7种小亚基为各种RNA聚合酶特有都具有原核RNA 聚合酶核心2同源的亚基最大亚基与相似，次最大亚基与相似,真核生物RNA聚合酶的共同特征,真核生物RNA 聚合酶II（RNA Pol II）,与模板结合；与转录起始、延伸有关与DNA、底物和新生的RNA结合负责酶的装配,250KDa,130KDa,40KDa,40KDa,由814个亚基组成，分子质量为500KDa,B

7、220240Kda与模板结合，与链的起始，延伸有关，相 当于原核 RNA Pol的亚基C端含有羧基末端功能区 大亚基 B140150Kda与DNA、底物和新生的RNA结合，相当于原核RNA Pol B44.5酶的连接，相当于原核RNA的亚基RNA Pol ABC 27KDa 磷酸化蛋白，1类三种RNA Pol共有，如 ABC 25.5KDa 与DNA结合有关 ABC 23KDa B 12.6 小亚基 2类Pol 特有 B 23 B 14.5 B 10 3类在某些条件下可除去的亚基 B 23参与酶的基本结构 B 16.5细胞器的RNA Pol和噬菌体的RNA相似，因有单一固定的功能，分子量较小真

8、核生物聚合酶的成分及功能,（二）RNA聚合酶 羧基末端结构域（CTD）：1、位置：RNA聚合酶最大亚基羧基末端 2、结构特点：（1）具有7个氨基酸（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser）的重复序列（酵母：重复26次；哺乳类：52次）（2）多个磷酸化位点：Ser、Thr,作用 CTD磷酸化对调控基因转录有重要作用：（1）CTD去磷酸化，RNA聚合酶II易与DNA 结合，这种构象适于转录的起始；（2）CTD磷酸化可使RNA聚合酶II与DNA的 结合变得松弛，形成适于延伸的构象,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upst

9、ream)的调控序列,模板上酶的辨认、结合,位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的DNA顺序称为启动子（promoter),开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site),典型启动子的结构,-35-10 转录起点TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp,原核生物中转录起始区的共同序列,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,类启动子和调控

10、区,TATA框 核心元件 启始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5构成，位于-3+5，可能提供RNA pol 识别。CAAT box、类启动子 上游元件组成 GC box Oct 增强子（enhomcer）远端调控区 减弱子（dehancer）静息子（sisencer）上游激活序列（upstream activating seguences UASs）,8.3 转录过程The Process of Transcription,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物的

11、转录过程,2.DNA双链解开,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,转录起始过程,转录复合物形成后，可以进入两种途径：流产式起始：合成并释放29个核苷酸的RNA短链释放亚基，通过启动子区，生成转录延伸复合物（核心酶、DNA和新生的RNA）,（二）转录延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP

12、)n+NTP(NMP)n+1+PPi,转录泡(transcription bubble)：,RNA-pol（核心酶）DNA RNA,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。在原核细胞中有两种不同的终止子，一种是强终止子，另一种是弱终止子。强终止子在体外实验中，无需其他任何因子的帮助就可以终止核心酶，这种终止子被称为内部终止子（intrinsic terminators）。弱终止子需要在一种蛋白质因子（rho factor）的帮助一才能终止，所以又称为依赖性

13、终止子（Rho-dependent terminator）。,A T P,1.依赖 Rho因子的转录终止,2.非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT

14、.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,二、真核生物的转录起始,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,真核RNA聚合酶II启动子和增强子通过蛋白质的介导互相结合，形成环，启动转录(引自Griffithset al1999),真核生物的转录和原核转录的不同点,(1

15、)原核只有一种RNA聚合酶，而真核细 胞有三种聚合酶(2)启动子的结构特点不同，真核有三种 不同的启动子和有关的元件(3)真核的转录有很多蛋白质因子的介入,(三)RNA pol启动子,核心启动子（core promoter）或核心元件（core element），位于-45到+20，负责转录的起始。上游控制元件（upstream,control element UCE），从-180延伸到-107，可增加核心元件的转录起始的效率。,1701601501401301201106050403020 10 1 1020 上游控制区 核心启动子 UBF1 UBF1结合于GC 丰富区 SL1 SL1与UB

16、F1协同结合TFB Pol 1?,1 型内部启动子 2 型内部启动子 转录起始点 转录起始点 boxA boxC boxA boxB TFIIIA TFIII C TFIII C TFIII B TBP A B TFIII C TFIII B Plo III Pol III,RNA pol 启动子的转录因子的结构和功能因子 结构 功能TFA 38Kda,有9个锌指 结合于1型内部启动子(5sRNA基因)的C框，使C结合在C框下游，辅助 B定位结合TFB 含TBP和另外二种蛋白定位因子，使Pol结合在起始位点上TFC 含A和B,有5个亚基 B结合型内部启动子(tRNA基因)的B框，起增强子的作用

17、。A结合A框，起启动子 的作用；辅助 B定位结合TBP是B,D,SL1的亚基和特异DNA序列及RNA Pol结合，使Pol结合 在正确的位点上TFD含TBP亚基 结合TATA框，确定选择Pol PBP次近端结合蛋白 可能和D一道辅助 B定位结合的另一途 径,TBP Pol III 启 动 子 TFIIIB TFIIIC TBP RNA Pol III Pol I 启 动 子 SL1 RNA Pol I TBP UBF1 Pol II 启 动 子 TFIID TATA 转录起始点 RNA Pol II,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting ele

18、ment),1.转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2.转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors,TF)。,参与RNA-pol转录的TF,人类型启动子的转录因子因子 分子量 功能RNAPol 10K 依赖模板合成RNATFA12,19,35K 稳定TFD和DNA的结合，激活TBP亚基

19、TFB33K 结合模板链（-10+10），起始Pol结合，和TFE/F 相互作用TFD(TBP,30K)TBP亚基识别TATA，将聚合酶组入复合体中，TAFs识别 特殊启动子TFE34K()结合在Pol的前部，使复合体的保护区延伸到下游 57K()TFF38,74K 大亚基具解旋酶活性（RAP74）,小亚基和Pol结合，介导其加入复合体TFH 具激酶活性，可以磷酸化PolC端的CTD，使Pol逸出，延伸TFI120K 识别Inr，起始TFF/D结合TFJ 在TFF后加入复合体，不改变DNA的结合方式TFS RNA合成延伸,顺式作用元件,在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”

20、（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）顺式作用元件是同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列存在于基因旁侧序列它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质,仅仅提供一个作用位点,要与反式作用因子相互作用而起作用,3.转录起始前复合物(pre-initiation complex,PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,

21、4.模板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性、有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰

22、点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关。,8.4 转录的调节控制,原核生物转录的调节控制,转录的调节控制是基因表达调节控制中的一个重要环节促进基因转录叫正调节抑制基因转录叫负调节 1961年F.雅各布和J.莫诺提出的操纵子学说，得到许多人的验证和充实操纵子通常的调控方式为：诱导和阻遏作用；环腺苷酸(cAMP)和降解物活化蛋白(CAP)的调节作用；弱化作用,真核细胞基因转录的调节控制,目前知道得很少。同种高等生物每个个体的各个体细胞都有全套相同的基因，只是由于在发育过程中基因表达的调节控制（包括转录的调节控制）不同，因而发育成各种不同的组织

23、和器官。目前认为，动物（包括人）都含有癌基因，但有的致癌，有的则不致癌，这也可能是由于转录与翻译的调控不同另外，真核DNA中的结构基因只占总量的10左右，大部分 DNA顺序都可能起调节控制作用真核生物也有诱导酶和诱导蛋白质，如干扰素就是由病毒或双链RNA等诱导产生的一种蛋白质,转录抑制剂,转录能被一些特异性的抑制剂抑制，有些抑制剂是治疗某些疾病的药物，有的则是研究转录机理的重要试剂按照作用机理的不同，转录抑制剂分为两大类第一类抑制剂特异性地与 DNA链结合，抑制模板的活性 使转录不能进行，这类抑制剂同时抑制DNA复制。例如：放线菌素D、纺锤菌素、远霉素、溴乙锭和黄曲霉素等第二类抑制剂作用于RNA聚合酶，使RNA聚合酶的活性改变或丧失，从而抑制转录的进行。这类抑制剂只抑制转录，不影响复制，是研究转录机制和RNA聚合酶性质的重要工具。例如：利福平、曲张链霉素、利链霉素和-鹅膏蕈碱等,