《RNA提取系列》PPT课件.ppt
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1、核酸纯化系统,TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.,LTD,RNA提取专项,RNA相关知识及提取原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,AAAAAA,RNA相关知识及提取原理细胞中RNA的种类和含量,RNA相关知识及提取原理RNA的裂解原理,异硫氰酸胍/苯酚法,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解,同时核蛋白体上的蛋白变性,核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相,从而得以分离,胍盐/-巯基乙醇法,盐酸胍裂解样本,抑制RNase的活性-巯基乙醇变性蛋白,RNA相关知识及
2、提取原理RNA吸附原理,沉淀法介质吸附,RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,RNA提取流程,1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得,RNA提取流程 样品前处理注意点,选择新鲜血液,不得超过4小时,选择新鲜的幼嫩组织,选择处于生长旺盛的时期收集细胞,选择新鲜组织,生长旺盛的组织,可将新鲜血液先进行红细胞裂解,得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol,-70保存较长时间,去掉培养基,加入一定量TRNzol-70 保存较长时间,推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存,液氮或加入RNase抑制剂中保存,避免反复冻
3、融,RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本,样品的前处理方式,RNA提取流程样本前处理的目的:离散,均一,细胞集或细胞液,液氮研磨,匀浆或液氮研磨,应用红细胞裂解液处理,蛋白酶K处理,RNA提取流程样品前处理Q&A,Q-1:样品量是否越多越好?A-1:不是。在试剂盒规定内增加,若过度增加样品处理量会影响RNA得率;如增加样品起始量,则后续实验中各溶液量均要相应按比例增加。,Q-2:如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解?A-2:研磨过程要迅速,同时尽量避免外源RNA酶污染;匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触,尽量在匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中,可确保RNA不被降解。,RNA提
4、取流程样品前处理Q&A,1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得,RNA提取流程,RNA提取流程细胞裂解,以释放RNA,异硫氰酸胍/酚TRNzol总RNA提取试剂,独特配方-RNAplant植物RNA提取试剂,胍盐/-巯基乙醇RNAprep系列RNA提取试剂盒,RNA提取流程,1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得,RNA提取流程 RNA的纯化及获得,RNA纯化要求,1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2 排除有机溶剂和金属离子的污染3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4 排除DNA分子的污染,RNA相关知识及提取原理RNA提取流程实验举例及实验中注
5、意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护,实验举例,使用试剂(以TRNzol A为例)使用试剂盒(以RNAprep pure试剂盒为例),操 作 流 程,样品前处理、细胞裂解,试剂,试剂盒,纯化,沉淀,加入吸附柱,洗涤,溶解RNA沉淀,获得RNA产物,加缓冲液,漂洗,RNA洗脱收集,细胞,实验举例应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA,细胞选择,贴壁细胞 悬浮细胞,样品处理量与加入的TRNzol-A+的量要对应1mlTRNzol-A+对应:1 血液0.2-1ml 2 动植物组织30-50mg 3 贴壁细胞:每10cm2培养面积 4 悬浮细胞:5-10106细胞,等体积异丙醇沉淀
6、,70乙醇洗涤沉淀,晾干溶解,RNA吸附柱,去蛋白液,漂洗,洗脱,水相RNA,传统方法:有机溶剂抽提,得率高,柱纯化法:纯度高,实验举例应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA,图片说明:M:TIANGEN Marker IIIA:A公司同类产品提取动物细胞结果T:TIANGEN公司TRNzol-A提取动物细胞结果,试验材料:Hela cell/106实验方法:TIANGEN公司 TRNzol-A+A公司同类产品试验结果:得率:TRNzol-A+得率与A公司同 类产品略高 纯度:经TRNzol-A+纯度较高,无明显DNA、蛋白残留,M,T,A,1 2 3 4 5 6,实验举例应用TRNzol-
7、A+提取动物细胞RNA,实验注意事项应用TRNzolA的注意点,前处理,裂解,沉淀,洗涤,抽提,溶解,RNA降解,处理样品量,上清吸取,杂质去除,适量异丙醇,乙醇,盐离子残留,RNA不宜太干,操 作 流 程,样品前处理、细胞裂解,试剂,试剂盒,纯化,沉淀,加入吸附柱,洗涤,溶解RNA沉淀,获得RNA产物,加缓冲液,漂洗,RNA洗脱收集,实验举例应用RNAprep pure提取动物组织,动物组织,研磨或匀浆,植物组织30-50mg动物组织10-20mg悬浮细胞107贴壁细胞10cm2血液,胍盐、-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子
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