SDSPAGE凝胶电泳.ppt

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1、SDS-PAGE凝胶电泳,SDS-PAGE凝胶电泳,实验原理实验步骤注意事项SDS-PAGE的优点SDS-PAGE的缺点实验常见问题及处理小技巧,实验步骤,试剂配制(1)30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。4，12月（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)：称取Tris 18.2g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。,（4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8):称取Tris12.1g,加入50ml水，

2、用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml（5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml（）TEMED（四甲基乙二胺）,（）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml（）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀（）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用,（1）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50m

3、l，加蒸馏水定容至1000ml（1）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml,.聚胶前准备,(1)配制10过硫酸铵溶液(需每天新鲜配制)。(2)将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配制成凝胶溶液。(3)将灌胶装置准备好。(4)待凝胶溶液平衡至室温(2325)后，真空脱气15 min。,不连续系统下层分离胶的聚合,在10 ml凝胶溶液中加入10过硫酸铵50 l(最终浓度为0.05)，TEMED原液5l(最终浓度为0.05)。轻缓地摇动溶液(8

4、10下)，使激活剂混合均匀。将凝胶溶液平稳地注入两层玻璃板中(注意要以连续平稳的液流从中间位置注入)，再在液面上小心注入一层水或正丁醇(约23mm高)，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置至少90 min。,不连续系统中的上层浓缩胶 和连续系统凝胶的聚合,连续系统只含一种凝胶，它和不连续系统中的浓缩胶具有相同之处，即在其液面处与空气相接触，因此激活剂的含量应相应地增加，在10m1凝胶溶液中加入10过硫酸铵50 l(最终浓度0.05)，TEMED原液10 l(最终浓度0.1)。,同前将激活剂混合均匀，但摇动溶液时不要摇得过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液

5、流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡。静置90 min以上以保证完全聚合。如果在聚胶过程中发现一道道纹线，即凝胶不均匀，可能是聚合速度太快或激活剂未充分混合导致局部浓度过高。,凝胶聚合的速度可以通过紫外吸收检测，由于丙烯酰胺中的双键在260nm有吸收，聚合后双键消失，光吸收减低。将凝胶溶液倒入石英比色杯中，可观察到2030 min后光吸收读数开始下降，至80 min以后趋于稳定，说明聚合完成。,电泳,将聚合好的凝胶板安置于电泳槽中，上样，选择适当的电压进行电泳。,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，

6、大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,染色和脱色,电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣，此外根据不同的研究目的，也可将凝胶直接进行放射自显影及电印迹。,电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片,.结果处理,测量并计算分子量蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式 Mw K(10bm)(1)lgMw=lgKbm=K1bm(2)其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数 b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。mR=dpr/dBPB,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电

7、泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,相对迁移率,实验注意事项,1.形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有：丙烯酰胺、线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。2.注意不能随便倾倒单体溶液，应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。,3.TEMED中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧

8、化产物呈黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。,4.过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂凝胶)。,5.激活剂的用量:激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝

9、胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。,6.温度的影响聚胶的最佳温度为2325，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。,7.氧气的影响氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。通常在较好的真空度(125torr)脱气至少15 min。,8.凝胶添加剂：凝胶中常常加入SDS、尿素、

10、Triton X-100等添加剂。SDS加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。,9.聚胶时间：虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶1520 min即可观察到凝胶的形成，但至少需90 min才能保证95以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很长时间(完全聚合需8 h)。,10.单体的浓度：是指单体总重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可选择的范围为330，单体浓度增加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。

11、11.SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。,12.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10误差，不可完全信任。13.有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。,14.有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条

12、肽链的相对分子量。15.如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。,常见问题及处理办法,纹理和拖尾现象由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。,电泳时间比正常要长可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率。,.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合

13、不完全.凝胶时间不对通常胶在30min内凝聚如果凝聚得太慢，可能是TEMED，AP试剂不够或者失效,7.出现“皱眉”（两边向下中间鼓起）主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。,8.出现“鬼带”如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在

14、WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。,9.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。,SDS-PAGE的优点,设备简单快速分辨率和灵敏度高 特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定,SDS-PAGE的缺点,1.有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚

15、基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。,SDS-PAGE的缺点,2.还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在SDS-凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。,小技巧,1：电泳缓冲液的使用：电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但前提是每次的内层缓冲液必须是新配的。每次在电泳完成后内外层缓冲液一起回收到一个瓶里，作为下次的外层缓冲液使

16、用。就是配制新的缓冲液只作为内层使用（配制1L可以用很久的），每次都用回收的缓冲液作外层，效果一点都不差，即节省了试剂，又节省了时间。,2：电泳条件的选则 电泳不采用先低压再高压的常用方法，每次都是上样后直接采用200V恒压电泳，一般BioRad的胶板，39min即可跑到头，电泳结果一点都没有影响。,3：染色与脱色 分子克隆上介绍的方法耗时太长，现在用Crystal的方法已经相当快了，稍做改动：染色时加入染液后，在微波炉中煮沸一次即可，切记不要喷了，这个过程大约2030秒，在摇床上染色，这时可以去处理胶板，电泳槽，台面，待收拾干净后染色也就结束了（不要觉得染色时间太短了，已经足够了，太长了脱色也麻烦），此过程大约需要35min；回收染液，用自来水清洗几次胶，再加入适量自来水，放入微波炉中煮沸，条件与染色时一致，摇床脱色，此时你就可以做其他试验了，35min后可以再换一次清水，煮沸脱色，我的经验是一次用水脱色就可以看到Marker条带了，两次以后就可以清析的看到你的结果了，如果觉得结果不错可以留存备用，再加入脱色液，脱干净了就行了。,Thanks For Your Attention!,