RNA的生物合成、转录后加工和调节.ppt

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1、暨南大学药学院,1,细胞与分子生物学,暨南大学药学院,2,内容,第四篇 遗传信息的储存、传递和调控16章 DNA的复制及损伤修复17章 RNA的生物合成、转录后加工和调节18章 蛋白质的生物合成及其加工修饰19章 基因表达的调控20章 重组DNA技术21章 基因诊断与基因治疗,暨南大学药学院,3,17章 RNA的生物合成、转录后加工和调节,暨南大学药学院,4,第一节 基因转录的基本性质,转录是以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。DNA上的转录区域称为转录单位 转录是基因表达的第一阶段也是基因调节的主要阶段。,暨南大学药学院,5,转录与复制的异同

2、,暨南大学药学院,6,结构基因 DNA分子中编码RNA的区段模板链 Watson W链 负链编码链 Crick C链 正链不对称转录 不同基因的模板链核编码链并不是固定在某一条链上。,暨南大学药学院,7,RNA聚合酶特点：以核糖核苷三磷酸（rNTP）为底物；以DNA为模板；按53方向合成；无需引物的存在能单独起始链的合成；合成时，第一个引入的NTP是以三磷酸形式存在；在体内DNA双链中仅一条链作为转录的模板；RNA的序列和模板是互补的；RNA聚合酶无校正能力。原核生物的RNA聚合酶细菌中只有一种真核生物的RNA聚合酶真核生物有三类不同的,第二节 RNA聚合酶,暨南大学药学院,8,RNA的酶促合

3、成,暨南大学药学院,9,一、原核生物的RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶的组成450kd，5个亚基2个Alpha亚基参与全酶的组装及识别启动子亚基与NTP及新生链结合亚基与模板DNA结合亚基辨认转录起始点，延伸阶段与核心酶分离，一种转录辅助因子,暨南大学药学院,10,因子原核只有一种RNA聚合酶，但有多种因子在不同的条件下被表达，并与相应启动子结合基因启动子35和10区的保守序列是其识别位点,暨南大学药学院,11,RNA polymerase in prok.,Core Enzyme,Holo Enzyme,暨南大学药学院,12,基因 产物 功能,E.coli RNA Pol 的结构和功能,r

4、poA 2 亚基(每个40kD),酶的连接，装配启动子的识别结合某些活化因子,rpoB 亚基(160kD),rpoC 亚基(160kD),rpoD 亚基(3290kD),和底物结合,催化核心,和模板结合,和启动子结合识别模板链,暨南大学药学院,13,暨南大学药学院,14,RNA 聚合酶需执行多功能：识别DNA双链上的启动子；使DNA在启动子处解链成单链；通过阅读启动子序列，RNA聚合酶确定它自己的转录方向和模板链；最后当它达到终止子时，通过识别停止转录,暨南大学药学院,15,二、真核生物的RNA聚合酶,已发现有3种对抑制剂鹅膏覃碱的敏感性有差异转录产物不同,暨南大学药学院,16,转录何处开始？

5、启动子DNA模板上被RNA聚合酶识别并结合形成转录起始复合物的区段。原核生物启动子真核生物启动子,第三节 与转录有关的DNA结构,暨南大学药学院,17,一、原核生物启动子,研究方法 足迹法p340起始点 A or G10区 一致序列TATAAT pribnow box35区 一致序列TTGACA 因子识别位点，全酶结合于此，Sextama box1035区间隔序列 长短比序列重要,暨南大学药学院,18,大肠杆菌启动子的保守序列,暨南大学药学院,19,RNA聚合酶I 的启动子rRNA 45s RNA，再加工成5.8s,18s,28s rRNA，启动子由核心启动子和上游的调控元件组成,二、真核生物

6、启动子,暨南大学药学院,20,RNA聚合酶II 的启动子有3处顺式作用元件90的GC盒，70的CAAT盒，30处的TATA盒转录起点与原核生物相似，大多为A或GmRNA，种类繁杂，启动子多样性，还发现其它的相关元件。各种元件有不同的组合。II是最活跃的聚合酶。,暨南大学药学院,21,真核RNA聚合酶II启动子和增强子通过蛋白质的介导互相结合，形成环，启动转录,暨南大学药学院,22,真核启动子含有的各种元件和分布,暨南大学药学院,23,RNA聚合酶III的启动子催化snRNA,tRNA,5S RNA的转录需要其它辅助因子共同作用snRNA启动子与蛋白质基因启动子相似tRNA,5S RNA内部启动

7、子,暨南大学药学院,24,真核RNA启动子的基因内启动子和基因外启动子,暨南大学药学院,25,真核启动子不同于原核的特点,有多种元件；结构不恒定；它们的位置、基序、距离和方向都不完全相同；有的有远距离的调控元件存在，如增强子、沉默子等；这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；不直接和RNA Pol结合。,暨南大学药学院,26,转录的起始转录的延伸转录的终止,第四节 转录过程,暨南大学药学院,27,转录的起始,原核生物转录的起始真核生物转录的起始,暨南大学药学院,28,原核生物的转录起始,1.核心酶在因子的参与下与模板的DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动；2.起始识别

8、：全酶与模板的启动子结合，产生封闭的“酶-启动子二元复合物”（closed binary complex）；3.酶紧密地结合在启动子的-10序列处，模板DNA局部变性，形成“开放的启动子二元复合体”（open binary complex）；4.酶移动到转录起始点上，第一个rNTP转录开始，因子释放，形成酶-启动子-rNTP三元复合体。,暨南大学药学院,29,E.coli转录的起始,暨南大学药学院,30,真核生物的转录起始,每种RNA聚合酶都需要一些蛋白质辅助因子，即转录因子，transcription factor（I,II,III类分别对应于聚合酶）,暨南大学药学院,31,RNA聚合酶I催

9、化的起始,转录起始点上游有2个顺式作用元件，核心元件core element和上游调控元件UCE。RNA聚合酶I催化的转录需要2种转录因子，上游结合因子UBF和选择性因子1，SL1。SL1有4个亚基，一个是TATA盒结合蛋白TBP,另3个是TBP相关因子TAF。,暨南大学药学院,32,p342,UBF和UCE结合令DNA发生弯曲，使相距上百bp的UCE 和核心元件靠拢，接着SL1和polI相继结合到UBF-DNA复合物上，完成复合物的组建，开始转录。,暨南大学药学院,33,Allows RNApol binding complex to initiate,暨南大学药学院,34,RNA聚合酶II

10、催化的起始,转录因子：需要较多的转录因子参与转录起始复合物的组装：TFII-D与TATA盒结合，如无TFII-A的存在，TFII-D启动子复合物与抑制因子结合。TFII-A存在时与TFII-D结合成D-A复合物，防止复合物与抑制因子的结合，继而与TFII-B结合。聚合酶与TFII-F先形成复合物后再结合到DNA上，此时不能启动转录，必须TFII-E和TFII-H/TFII-J的参与。TFII-H是最后加入的因子，有解旋酶的活性，使起始部位DNA解链。TFII-H还有蛋白激酶活性，使pol IIC端多个丝氨酸残基磷酸化，这是聚合酶离开起始点继续转录的重要因素。,暨南大学药学院,35,真核生物的转

11、录,RNA Pol 的转录起始,暨南大学药学院,36,暨南大学药学院,37,Wilds minor groove,pre-TIC,Basic TIC,conclusion,暨南大学药学院,38,Promoter clearance,Transcription starting,暨南大学药学院,39,RNA聚合酶III催化的起始,需要3个蛋白质因子TFIII-A,B,C。tRNA基因转录的起始：在DNA上的调控序列位于起始转录位点的下游，称为内部启动子。有2个调控区，A盒和B盒。5s RNA基因转录的起始：除了TFIII-B,C外，还需要TFIII-A，首先TFIII-A结合到下游C盒，然后TF

12、III-C结合到A盒和B盒，继而是类似tRNA的转录,暨南大学药学院,40,暨南大学药学院,41,TFIIIB allows RNApol III to bindand initiate transcription,tRNA,+1,暨南大学药学院,42,rRNA,5s pre-rRNA transcription,暨南大学药学院,43,转录的延伸,延伸阶段，原核和真核比较相近。,暨南大学药学院,44,原核生物的延伸：核苷酸链中的的一个磷酸二酯键形成后，因子从全酶中解离出来，核心酶沿DNA分子移动。真核生物：RNA聚合酶需要较多的转录因子，起始后酶的移动也靠多种转录因子的共同作用使酶的构象发生改

13、变来实现，如在TFII-H的作用下，polII C端丝氨酸的磷酸化是向下游移动的重要因素。,暨南大学药学院,45,转录的延伸,延伸时RNA 聚合酶以稳定收缩和突然伸展的方式在DNA上“爬行”，稳定的收缩是指RNA聚合酶从35bp长连续地收缩到28bp，然后前端又突然向前伸展8bp,RNA聚合酶又恢复到35 bp长。,暨南大学药学院,46,转录泡p345,在转录延伸的过程中，DNA双链需要解开1020bp，形成的局部单链区象一个小泡为了保持局部的转录泡状态，在RNA聚合酶下游的DNA需要不断的解链，可使其下游的DNA越缠越紧，形成正超螺旋，而其上游的DNA链变得松弛，产生负超螺旋。解旋酶和拓扑酶

14、可以消除这些螺旋,暨南大学药学院,47,第一个磷酸二酯键的形成是由第一个核苷酸的3OH与第二个核苷酸的5磷酸之间脱水形成的。第一个核苷酸的5三磷酸保留在转录局部形成的RNA:DNA杂合双链之间的力比DNA双链的弱，存在A:U配对，延长中的RNA链的5端会被重新形成的DNA双链挤出，使合成中的RNA链的5端游离于转录复合物。,暨南大学药学院,48,转录的终止,生物转录的终止处有特殊结构的存在，称为终止子 在原核细胞中有两种不同的终止子，一种是强终止子，另一种是弱终止子。强终止子在体外实验中，无需其他任何因子的帮助就可以终止核心酶，这种终止子被称为内部终止子（intrinsic terminato

15、rs）。弱终止子需要在一种蛋白质因子（rho factor）的帮助一才能终止，所以又称为依赖性终止子（Rho-dependent terminator）,暨南大学药学院,49,强终止子的结构,强终止子的结构有三个特点：有回文结构存在。由它转录出mRNA可形成茎环结构，可阻止RNA 聚合酶的前进；茎的区域富内含G-C，使茎环不易解开；强终止子3端上有6个U，由于它和模板形成的连续U-A配对较易打开，从而便于释放出RNA。,暨南大学药学院,50,弱终止子的结构,它也可形成茎环结构，但在茎中的G.C含量少，茎环易打开。在其3端也没有寡聚U，因此RNA 聚合酶合成此段RNA后，由于茎环的存在可使聚合酶

16、暂停一下，若此时因子追上来和聚合酶结合，那么转录即可终止，若无因子聚合酶还可越过终止进行“通读”。,暨南大学药学院,51,RNA聚合酶转录mRNA因子附着到mRNA识别位点因子在RNA聚合酶后面沿mRNA移动RNA聚合酶在终止位点停留，因子赶上了聚合酶在转录泡中因子解开DNA-RNA杂合链终止RNA聚合酶，因子和RNA被释放,在原核mRNA转录中依赖性终止机制,暨南大学药学院,52,依赖性终止子，其共同特点是C丰富，G缺乏,暨南大学药学院,53,RNA聚合酶转录出mRNA后核糖体结合到mRNA上核糖体在突变位点解离因子追上了RNA聚合酶转录提前终止,无义突变时因子可能使转录提前终止,暨南大学药

17、学院,54,原核转录的过程,暨南大学药学院,55,真核生物转录的终止,机制了解不多，且3种聚合酶的转录终止不完全相同。RNA聚合酶I催化的转录有18bp的终止子序列，可被辅助因子识别。RNA聚合酶II和III催化转录的终止子，可能有与原核生物不依赖因子的终止子相似的结构和终止机制，即有GC的茎环结构和连续的U。由于成熟的mRNA3端已被切除了一段，并加入了polyA尾巴，具体的转录终止点目前尚未认识。,暨南大学药学院,56,真核生物的转录终止,真核生物的RNA大部分都要经过加工，包括剪切和加上poly(A)，因此对于其终止的情况了解很少，只有少数的例子搞得比较清楚。前体RNA转录的终止是随着组

18、织的变化而变化。例如在爪蟾中有两个重要的转录终止位点：T2和T3。T2是28SrRNA序列3末端下游约235bp序列。T3是排列在下一个转录单位的上游约200bp处。T2和T3都含有7个碱基的保守序列：5-GACTTGC-3。T2是前体rRNA转录的初始终止位点。T3是作为“失败-保险”的终止位点，由于rDNA转录单位是串联排列的，所以“失败-保险”终止系统让RNA Pol分子可能在一个转录单位上起始和转录。,暨南大学药学院,57,第五节 RNA转录后加工,原核生物RNA转录后的加工mRNA转录后的加工rRNA转录后的加工tRNA转录后的加工真核生物RNA转录后的加工rRNA转录后的加工tRN

19、A转录后的加工mRNA转录后的加工,暨南大学药学院,58,原核生物RNA转录后的加工,mRNA的加工：mRNA转录产物，一般无需加工即具有活性，可作为翻译的模板。但近年也发现要添加3polyA的现象。tRNA,rRNA的加工修饰较多。rRNA的加工：rRNA基因常与一些tRNA基因混合组成一个操纵子，呈有序排列。RNA酶III对其转录产物进行切割，其产物还需再加工才成为成熟的rRNA，具体机制不明。,暨南大学药学院,59,原核生物RNA转录后的加工,tRNA的加工：原核生物tRNA的初始转录产物有几种形式，1、与rRNA相连；2、相同的几个拷贝连在一起；3、不相同的几个连在一起。要经过多个加工

20、程序才能成为成熟的tRNA。参与tRNA加工的酶类有多种包括：RNA酶III，RNA酶D，RNA酶P，tRNA核苷酸转移酶,暨南大学药学院,60,真核生物RNA转录后的加工,rRNA的加工：有5s，5.8s，18s，28s四种，其中5.8s，18s，28s 是由RNA聚合酶I催化一个转录单位（中度重复序列），产生45s rRNA前体，rRNA转录后加工包括前体rRNA与蛋白质结合，然后再切割和甲基化。转录在核仁进行，新生的前体迅速与蛋白质结合成前体核糖体颗粒，然后，其中的RNA经一系列切割先产生18s rRNA，该RNA与蛋白质组成核糖体的小亚基。余下的部分再拼接成5.8S,28S rRNA。

21、,前体rRNA的切割在特殊序列位点，可能是由核仁小RNA(snoRNA)催化。前体rRNA还接受蛋氨酸提供的甲基被甲基化，在切割加工后，甲基化仍保留，甲基化的位点在脊椎动物中是高度保守的。5sRNA 在核质中转录无需加工进入核仁与28s，5.8s rRNA及蛋白质一起组成核糖体的大亚基，以大亚基的形式通过核孔进入胞浆。,暨南大学药学院,61,真核生物RNA转录后的加工,tRNA的加工：包括切除和碱基修饰，有些需要剪接。所有tRNA5端比成熟tRNA多一段序列，由RNaseP切除。有些tRNA基因在反密码环处含有内含子，剪接加工与前体mRNA的加工有所不同：在内含子两端切割去除内含子后将外显子连

22、接，没有转酯反应。,暨南大学药学院,62,真核生物mRNA转录后加工,RNA聚合酶II催化转录，初始产物为核不均一RNA(hnRNA)，新生的hnRNA从开始形成到转录终止，就逐步与蛋白质形成不均一核糖核蛋白颗粒，前体mRNA加工的顺序是形成5帽子结构、内切酶去除3端序列、polyA聚合酶催化形成尾巴；剪接取出内含子变成成熟的mRNA,暨南大学药学院,63,5帽的形成,P348经鸟苷酰转移酶催化与另一个GTP作用在鸟嘌呤7甲基转移酶作用下，以S-腺苷蛋氨酸为甲基来源再经2甲基转移酶催化5帽子的类型,暨南大学药学院,64,前mRNA3端切除及加polyA尾,除组蛋白的mRNA外，真核生物所有的m

23、RNA都有3polyA尾。polyA上游1035bp有AAUAAA序列，下游约50bp有富含GU序列，这2处序列是剪切和加尾所需的信号。,暨南大学药学院,65,mRNA的剪接,剪接splicing几乎所有真核生物的核前体mRNA都有特征的GU/AG序列，称为GU-AG规则。内含子离3剪切点2050bp范围内有一个A也是不变的，称为分支点。分支点附近也有保守序列。,暨南大学药学院,66,剪接过程p350,由核小RNA与蛋白质组成的核小核糖核蛋白与内含子结合，通过snRNA中的U1snRNA与5剪接点互补结合，U2snRNA与内含子分支点序列互补，以及snRNP之间的相互作用，内含子折叠，使内含子

24、两侧的外显子靠近，利于剪接反应的进行。剪接反应通过2次转酯，释放出套索状结构的第一内含子。,暨南大学药学院,67,核mRNA从核内转运至胞浆mRNA在胞浆中的定位胞浆中mRNA的稳定性,第六节 mRNA的转运及其在胞浆中的定位、稳定性,暨南大学药学院,68,核mRNA从核内转运至胞浆,前体mRNA（hnRNA）的加工在核内特定的亚核结构（核基质）中进行。随着新合成的mRNA链延长，不断有hnRNP结合到链上，同时形成剪接体。加工成熟后，去除剪接的蛋白质，但有不少蛋白质结合，形成信使核糖核蛋白mRNP，成熟mRNA以mRNP的形式从细胞核内通过核孔进入胞浆。mRNPs在核内呈盘绕状，当它通过核孔

25、时就呈非盘绕状。,暨南大学药学院,69,核mRNA从核内转运至胞浆,mRNA的5端起导引作用，进入胞浆后即与核糖体结合，牵制住mRNA。5端帽子结构在mRNA从核内转运至胞浆过程的作用是被转运机制识别。mRNP进入胞浆后，与mRNA结合的蛋白质会发生更换，从核内随mRNA转运至胞浆的hnRNP的蛋白质组分解离，重新进入细胞核。组成mRNP的蛋白质组分结合到mRNA链上，特别是在3polyA结合蛋白（PABP），PABP与核内结合在polyA上的结合蛋白（PABPII）是不同的蛋白质。mRNP中蛋白质与RNA的比例比hnRNP中的少。,暨南大学药学院,70,mRNA在胞浆中的定位,胞浆中的mRN

26、A和核糖体一起与粗面内质网的膜紧密结合。结合在mRNA3polyA的PABP又与肌动蛋白微丝组成的细胞骨架结合。某些mRNA3非翻译区有特殊序列指引mRNA在细胞质中的位置。机制不清楚。,暨南大学药学院,71,胞浆中mRNA的稳定性,不同的mRNA稳定性相差悬殊根据功能不同而有所差异，真核生物多数mRNA半衰期可达数小时，调节因子的mRNA只需短时表达，半衰期较短。mRNA的3端非翻译区的AUUUA重复序列是不稳定因素。许多半衰期短的mRNA含有这类序列。mRNA的降解是可以调控的。转铁蛋白受体mRNA的稳定性调节，与其非翻译区铁应答元件IRE重复序列有关。,暨南大学药学院,72,思 考 题,RNA有很多种，它们分别由哪一种RNA聚合酶催化合成？和因子在转录过程中的作用是什么？homework不同RNA聚合酶的启动子有什么特征？RNA聚合酶II催化的转录起始有何特点？homework真核生物RNA转录后加工的内容是什么？真核生物内含子是如何剪接的？核RNA如何转运至胞浆？homework,暨南大学药学院,73,下 课Thank you！,