RNA的生物合成 转录.ppt

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1、RNA的生物合成RNA Biosynthesis,转录(transcription)：以DNA为模板指导合 成RNA的过程。是RNA合成的主要方式。RNA复制(RNA replication):以RNA为模板指 导合成RNA的过程。主要见于除逆转录病 毒以外的RNA病毒。,RNA生物合成有两种方式,转录(transcription)生物体以DNA为模板指导合成RNA的过程。,转录,mRNA(messenger RNA)把遗传信息从DNA中转录出来，作为蛋 白质合成的直接模板。tRNA(transfer RNA)各种氨基酸的载体并以其反密码子识 别mRNA上的密码子。rRNA（ribosomal

2、 RNA）与蛋白质共同构成核糖体，做为蛋白 质合成场所。,转录主要产物,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,GTP,CTP,UTP)模板:基因区的DNA单链酶:DNA依赖的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,一、转录模板 RNA的转录为不对称转录(asymmetric transcription)，有两方面含义：在DNA双链分子上，对于某基因，一股链可转录（模板链），另一股链不转录（编码链）。模板链并非永远在同一单链上。,第一节 原核生物转录的模板和酶,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,转录中RNA生成的

3、方向是53方向延长，模板链为35方向。,模板链(template strand)按照碱基配对原则指导转录生成RNA的DNA单链。又称有意义链、Watson链。编码链（coding strand)模板链的互补链。又称反意义链、Crick链。其碱基序列与mRNA一致，若以U代替T。文献中刊出的基因序列为编码链。,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,亚基（因子）,核心酶2,全酶2,大肠杆菌(E.coli)的RNA聚合酶：,二、原核生物

4、的RNA聚合酶,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzyme),亚基：功能是辨认转录起始点。2称核心酶(core enzyme)：催化NTP按模板的指引合成RNA。转录延长阶段仅需核心酶。全酶(holoenzyme)：转录起始时需全酶。,启动子（启动序列）,操纵序列,结构基因（几个）,操纵子,其他调节序列,调控序列,原核生物基因转录模式：操纵子模式,三、模板与酶的辨认结合,操纵子：每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子。,结构基因（编码序列）,启动子,操纵序列,其他调节序列,(promoter),(operator),原核生物操纵子（operon）,启动子(promoter

5、)是转录起始时RNA聚合酶结合模板DNA的部位。,原核生物启动子（RNA聚合酶保护区）,约4060bp大小。以结构基因第一个碱基为1，以负数表示基因上游，在启动子的35区和10区存在保守序列或一致性序列。35区的一致性序列是TTGACA，是转录起始的辨认位点，由因子辨认结合。10区是TATAAT，也称Pribnow盒，与RNApol有较牢固的结合。,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点,5,5,RNA聚合酶保护区,结构

6、基因,3,3,原核生物启动子结构,RNA转录起始,-35区,-10区,TTGACA,TTAACT,TTTACA,TATGAT,TTTACA,TATGTT,TTGATA,TATAAT,CTGACG,TACTGT,N17,N16,N17,N16,N16,N7,N7,N6,N7,N6,A,A,A,A,A,trp,tRNAtrp,lac,recA,Ara,X/45,38 36 29 37 37 28,40 25 30 41 29 44,转录过程,转录起始转录延长转录终止,第二节 原核生物的转录过程,1.因子辨认转录起始点,全酶与之结合。因子辨认结合启动子35区的TTGACA序列。2.全酶随即移向10区

7、的TATAAT序列并跨入转录起始区。,一、转录起始,3.解开局部双链，在RNA-pol催化下，生成RNA第一个3,5磷酸二酯键，形成转录起始复合物。RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3 转录生成的RNA的第一位，即 5端总是GTP或ATP，以GTP更为常见。4.因子即从转录复合物上脱落，转录起始结束。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,二、转录延长,1.因子脱落后，在核心酶作用下，以NTP为底物，按照碱基配对原则（与DNA单链模板：C-G,A-U,T-A)，逐个生成3,5磷酸二酯键，延长RNA链。,2.酶是沿着模板链的35方向，转录产物是从53延长。3.转录空泡(tra

8、nscription bubble)亦称转录复合物，包括：核心酶、DNA模板和转录产物。4.在DNA模板上多个转录同时进行，转录的mRNA上多聚核糖体翻译。,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol（核心酶）DNA RNA,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,三、转录终止,有依赖因子（Rho）与非依赖因子转录终止两类 1.依赖因子的转录终止 因子由相同的6个亚基组成的六聚体蛋白质。因子可与RNA 3端polyC结合，有ATP酶活性和解螺旋酶的活性。,作用机制：RNA转录接近终点时，3末端出现polyC，因子与polyC结合

9、，因子和RNA聚合酶发生构象变化，RNA聚合酶停顿。因子ATP酶活性和解螺旋酶的活性使DNA:RNA杂化双链拆离，RNA从转录复合物中释放。,A T P,依赖因子的转录终止,2、非依赖因子的转录终止,结构：接近终止转录区，RNA转录产物3-末端有若干个连续的U,在此之前的部分碱基可形成鼓槌状的茎环结构(stem-loop)或发夹结构(hairpin)。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RN

10、A,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGCCUUUUUAGGCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,机理：茎环结构在RNA末端形成，改变RNA聚合酶的构象，使转录停顿。通过茎环结构与RNA聚合酶及DNA的相互作用，使RNA解离出来，转录终止。,茎环结构使转录终止的机理,一、真核生物的RNA聚合酶,RNA-pol RNA-polRNA-pol,RNA聚合酶,真核生物RNA聚合酶比原核生物复杂，其都有两个不同的大亚基和十几个小亚基。,第三节 真核生物RNA的生物合成,真核生物RNA聚合酶特性与催化产物,hnRNA(杂化

11、核RNA，hetero-nuclear RNA)：经加工生成mRNAsnRNA(核内小RNA,small nuclear RNA)：有多种，由100-300核苷酸组成，参与RNA的剪接过程。,启动子,增强子,沉默子,TATA盒（Hogness盒）,CAAT盒,GC盒,顺式作用元件,二、真核生物转录起始,真核生物转录模式：顺式作用元件+结构基因,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子或沉默子,真核生物转录模式,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,（一）顺式作用元件（Cis-acting element）,概念：是指可影响自身基因表达活性的DNA序列

12、。可位于结构基因两侧，多见于上游，包括启动子、增强子和沉默子。,启动子：保守序列常见有:TATA盒（Hogness盒，TATAAAA）CAAT盒(GCCAAT)GC盒(GGGCGG)某些启动子具有位于转录起始点附近 的保守序列，称为起始子(initiator,Inr)。,启动子保守序列可结合不同的转录因子，参与转录起始。TATA盒常是启动子的核心序列，可结合TBP(TATA binding protein，TATA结合蛋白)。转录起始时，多种转录因子结合于启动子，真核RNA-pol通过转录因子间接与启动子结合，与原核RNA-pol不同。,增强子(enhancer)：是远离转录起始点，具有增强启

13、动子转录活性的DNA序列。其可与增强子结合蛋白EBP(enhance binding protein)结合，促进转录。沉默子(silencer)：是远离转录起始点，可抑制基因转录的DNA序列。其可与转录抑制因子（transcription inhibitor）结合，抑制转录。,（二）转录因子(transcriptional factor),反式作用因子(trans-acting factor)某一基因表达的蛋白质间接或直接作用于另一基因的顺式作用元件，此类蛋白质称为反式作用因子。,（二）转录因子(transcriptional factor),转录因子(transcriptional fact

14、ors,TF)反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶者称为转录因子。,转录因子,基本转录因子,转录激活因子,特异转录因子,转录抑制因子,TFIID由两类亚基组成 TBP(TATA binding protein，TATA结合蛋白)TAF(TBP associated factors，TBP辅助因子),基本转录因子 是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白质因子，决定RNA的类别。相应于RNA-pol、，分别称为TFI、TFII、TFIII。TFII又分为TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH等。,参与RNA-pol转录的TF,(三)转录起始前复合物,真核生物

15、转录起始首先形成转录起始前复合物（pre-initiation complex,PIC）。TFII-D通过TBP结合TATA盒为核心，其他TFII逐步加入，与RNA-pol、启动子共同形成PIC。,DNA,TATA,转录起始前复合物（pre-initiation complex,PIC）,（四）转录起始复合物,转录起始前复合物PIC形成后，在迂回折叠DNA构象中，增强子结合蛋白EBP（enhance binding protein）结合增强子,同时与TFD中的TAF结合，最后形成转录起始复合物，启动转录。,DNA,TATA,EBP,真核生物转录起始复合物,三、转录延长,真核生物转录延长过程与原

16、核生物大致 相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位 和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,四、转录终止,基因读码框架下游，常有共同序列AATAAA（编码链），再下游有多个GT序列，两者之间为转录终止的修饰点。转录越过修饰点，mRNA在修饰点处被切断，随即加入polyA尾及5-帽子结构。RNA酶将余下的RNA降解，解螺旋酶和释放酶帮助终止转录。,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGT

17、GTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3切断并加尾,AAAAAAA 3 mRNA,转录中mRNA,解螺旋酶和释放酶,转录终止过程,原核生物转录生成的RNA一般不需加工即可使用，真核生物转录生成的RNA必须经加工后才能使用。,第四节 真核生物RNA加工,真核生物结构基因转录初产物为hnRNA，需加工才能成为成熟的mRNA。,5-端形成帽子结构 3-端加polyA尾巴 内部剪接mRNA的编辑,一、真核生物mRNA转录后加工,（一）5端形成帽子结构,形成过程：转录生成的hnRNA经与GTP反应，生成三磷酸双鸟苷(GpppG-)，再将第1或第2个G碱基7位N甲基化，形成帽子结构(7-甲基鸟嘌呤三磷

18、酸核苷,mGpppG-或GpppmG-)。帽子结构功能：使mRNA免遭核酸酶的攻击；与翻译起始有关。,5 pppGp,帽子结构的生成,5 ppGp,磷酸酶,Pi,（5 GpppmGp）,帽子结构,5 mGpppGp,（二）3端加polyA尾巴,形成过程：转录越过修饰点后，mRNA在修饰点处被切断，加入polyA尾巴。此过程有多种因子和酶参加。功能：维持mRNA 作为翻译模板的活性以及增加mRNA 本身稳定性。,1.hnRNA和断裂基因hnRNA：结构基因的初级转录产物，加工修饰后形成mRNA。hnRNA较成熟mRNA大几倍甚至数十倍。断裂基因(split gene)：真核结构基因，由若干个编码

19、区（外显子）和非编码区（内含子）互相间隔但又连续而成，转录后去除内含子再连接，故称断裂基因。,(三)内部剪接,2、外显子和内含子,外显子(exon):在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列（编码区）。内含子(intron)：隔断基因线形表达而在剪接过程中被除去的核酸序列（非编码区）。,鸡卵清蛋白断裂基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,3、mRNA的剪接（splicing),snRNA：分子中U碱基最丰富，故以U分类命名，有5种：U1、U2、U4、U5、U6。snRNP：5种snRNA和蛋白质组成5种小分子核糖核蛋白snRNP，参与mRNA剪接。

20、,剪接：去除初级转录产物中的内含子，把外显子连接为成熟的RNA。采用套索剪接，发生在核内。,剪接体：mRNA的剪接在剪接体上进行。剪接体由5种snRNP（U1U6 snRNP）组成。剪接体形成：大多数内含子结构为5-GUAG-3。首先是U1、U2 snRNP的U1、U2 与内含子边界序列结合，U4、U5、U6 snRNP加入，形成剪接体。,snRNP的U1、U2 snRNA与内含子结合,UACUACA-AG,UG,U4,U5,U6,E1,E2,U1,U2,剪接体的形成,剪接体催化中心：剪接体释放U1、U4、U5 后，U2 和U6 形成剪接体催化中心。此时，内含子弯曲成套索状，上下游外显子靠近。

21、,UACUACA-AG,UG,U6,E1,E2,UACUACA-AG,UG,U4,U5,U6,E1,E2,U1,U2,催化中心的形成,U2,剪接过程：在剪接体催化中心，发生两次转酯反应。第一次转酯反应：含鸟苷酸pG、ppG或pppG的辅酶，以3-OH对E1/I之间的磷酸二酯键作亲电子攻击，使共价键断开。第二次转酯反应：由E1的3-OH对I/E2之间的磷酸二酯键作亲电子攻击，使其断开，2个外显子相连而内含子被切除。,pG-OH(ppG-OH,pppG-OH),GU-OH,AGpU,pGpA,第一次转酯反应,GUpA,AGpU,外显子1,内含子,外显子2,AG-OH,GUpU,pGpA,mRNA的

22、剪切（cleavage)是mRNA前体剪去某些内含子，在上游的外显子3-端直接加polyA。剪切是某些mRNA的加工方式。剪切和剪接两种加工方式有时共用于某些mRNA的转录后加工。（参见书图11-23/24）,4、mRNA的剪切（cleavage),肠粘膜细胞有特异的胞嘧啶核苷脱氨酶，可与apoB基因转录的mRNA上第2153密码子CAA结合,将其C转变为U,使CAA变为终止密码子UAA,终止翻译。,（四）mRNA的编辑(mRNA editing),人类apo B基因,mRNA（14500个核苷酸）,肝脏apo B100（分子量为513 kD）,肠道apo B48（分子量为250kD）,mRN

23、A编辑,二、rRNA的转录后加工,1.rRNA 基因结构 真核细胞的rRNA基因属于一种丰富基因族的基因，在染色体上出现多个串联的基因。2.加工过程 rRNA基因转录生成45S-rRNA前体，其中包含有内含子，经剪接后形成18S、5.8S及28S rRNA。,rRNA的转录后加工,45S-rRNA,5.8S和28S-rRNA,内含子,内含子,28S,5.8S,18S,三、tRNA的转录后加工,tRNA转录后加工包括：,5端前导序列切除。3端少量碱基序列切除。中部内含子切除。3端加CCA-OH。稀有碱基形成。,tRNA的转录,tRNA初产物,RNA pol,DNA,RNAaseP,链接酶,内切酶

24、,RNAaseD,两端序列和内含子切除,核苷酸转移酶,ATP,3端加CCA-OH,甲基化：某些嘌呤甲基化。如：A mA,G mG还原反应：某些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶(DHU)。转位反应：尿嘧啶转变为假尿嘧啶(尿嘧啶由N1转变为C5与戊糖连接)脱氨反应：某些腺嘌呤脱氨成为次黄嘌呤(I)。,稀有碱基形成,（1）,（1）,稀有碱基形成,1982年Ceck等用纯化的细菌RNA-pol转录四膜虫细胞的rRNA前体，发现rRNA前体能进行自我剪接，变为成熟的rRNA，此时并没有其他蛋白质酶的存在。多种单细胞生物、线粒体、叶绿体中的rRNA和tRNA也具有自我催化剪接功能，均是转酯反应。因此诞生核酶概念。,四、核酶(ribozyme),核酶定义：具有催化功能的RNA。,