植生生化实验解读北大吴光耀.ppt

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1、2011年精英教案第五届全国中学生物竞赛培训,植生、生化实验解读课北京大学生命科学学院吴光耀 教授,1.蛋白质测定,(1)总N量测定 有机N(甘氨酸)+H2SO4 2CO2+3SO2+4H2O+NH3(NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 NH4HB4O7+HCl+5H2O NH4Cl+4H3BO3 用酸滴定氨,1.蛋白质测定,(2)双缩脲法 测两个以上的肽键 碱性环境双缩脲与Cu+生成紫红色化合物 540nm(NH2)2CO 2 NH2-CO-NH-CO-NH2+NH3,1.蛋白质测定,(3)Folin-酚法 是改进的双缩脲法 640nm同时测定了酪氨酸酚基。,1.

2、蛋白质测定,(4)紫外法 280nm 比色,1.蛋白质测定,(5)考马斯亮蓝法 考马斯蓝G-250可与蛋白结合,从红色染料转变成蓝色。595nm 测定吸收值,2.核酸测定,(1)RNA 测定地衣酚法 RNA+HCl 糠醛(核糖转变)糠醛+3,5-二羟基甲苯(地衣酚)鲜绿色 670nm比色,2.核酸测定,(2)DNA 测定 二苯胺法 DNA+冰乙酸 羟酮基戊醛(脱氧核糖转化)羟酮基戊醛+二苯胺 蓝色 595nm 比色,2.核酸测定,(3)定磷法 有机磷+高氯酸 无机磷 无机磷+磷钼酸钼蓝 660nm 比色,2.核酸测定,(4)紫外法 260nm 比色,3.质粒DNA提取和测定,(1)扩增质粒 L

3、B+氨苄青霉素(2)细菌裂解+碱(质粒DNA出来,染色体DNA变性)(3)沉淀蛋白+乙酸钾、酚-氯仿(4)纯化质粒DNA 水相质粒DNA用乙醇沉淀+RNase 溶于Tris缓冲液中(5)260nm测定,或电泳测定,4.DNA平板电泳,(1)制胶 Tris-硼酸缓冲液(TBE)+1%琼脂糖(2)加液 TBE液(3)加样 样品+花青素(4)电泳 滤光板看DNA移动过程,5.PCR(Polymerase chain reaction)-DNA扩增,(1)模板、引物、dNTP、聚合酶、缓冲液、Mg+(2)过程:模板双链分开 结合引物 新链合成(3)可用毛囊DNA Y染色体DNA,设计引物,PCR,男有

4、女无.,播放动画,6.层析,(1)分配层析 纸层析、液相层析(2)吸附层析 活性碳、氧化铝(3)交换层析 离子交换剂(4)凝胶层析 Sephadex Sepharose Superdex,7.糖的测定,(1)萘酚反应 糖+酸 糠醛+萘酚紫环反应(2)蒽酮反应 糖+蒽酮+硫酸兰绿色,7.糖的测定,(3)间苯二酚反应 酮糖+酸 羟甲基糠醛+间苯二酚 鲜红色(4)甲基间苯二酚反应 戊糖+酸 糠醛+地衣酚 兰色沉淀 己糖-褐色沉淀,8.还原糖测定(有自由醛基),(1)费林反应 葡萄糖+Cu(OH)2+NaOH 氧化亚酮 红黄色,9.叶绿素性质,双羧酸的酯 酯溶性.非极性溶剂(正己烷、石油醚)荧光+HC

5、l 去镁叶绿素+乙酸铜铜代叶绿素+NaOH 皂化,10.线粒体氧化磷酸化,磷氧比(P/O):这一电子传递链过程中,形成ATP的量与消耗氧分子之间的比为磷氧比,11.希尔用离心机分离了菠菜叶绿体,他在分离叶绿体中加入氧化态的氧化还原剂-2,6二氯靛酚(DCIP)后照光,发现DCIP被还原(氧化态兰色,还原态无色),并有氧的释放。,回答问题:(1)你认为分离叶绿体要下述哪些条件,A.一定pH的缓冲液B.溶液有一定的渗透势C.离心分离的叶绿体用水悬浮D.离心时,离心速度愈高愈好E.在摄氏4度操作和离心最好F.在室温操作最好,回答问题:(1)你认为分离叶绿体要下述哪些条件,A.一定pH的缓冲液B.溶液

6、有一定的渗透势C.离心分离的叶绿体用水悬浮D.离心时,离心速度愈高愈好E.在摄氏4度操作和离心最好F.在室温操作最好,回答问题:(2)你认为这一实验证明了什么?,光反应产生氧 B.CO2被还原C.光反应产生还原剂 D.水被光解,回答问题:(2)你认为这一实验证明了什么?,光反应产生氧 B.CO2被还原C.光反应产生还原剂 D.水被光解,希尔进一步实验,他将分离叶绿体悬液破碎,离心,分成绿色的沉淀和无色的上清液两部分,沉淀再用缓冲液悬浮。发现绿色部分照光可放氧,如将两部分在暗处混合,加入14CO2,一定时间后,则14C被标记在六碳糖上。,回答问题:(1)上述进一步实验说明什么?,A.光合作用可分

7、为需光和不需光两部分B.CO2固定是不需光的C.氧的释放要光D.水的氧化要光E.水的还原要光F.光产生还原剂G.还原剂用于CO2还原H.光通过叶绿体起作用I.六碳糖可氧化产生CO2,回答问题:(1)上述进一步实验说明什么?,A.光合作用可分为需光和不需光两部分B.CO2固定是不需光的C.氧的释放要光D.水的氧化要光E.水的还原要光F.光产生还原剂G.还原剂用于CO2还原H.光通过叶绿体起作用I.六碳糖可氧化产生CO2,回答问题:(2)实验中能否用NaH14CO3代替14CO2,A.不能 B.能,回答问题:(2)实验中能否用NaH14CO3代替14CO2,A.不能 B.能,单选题,1、这是Sti

8、tt研究果糖1，6-双磷酸酯酶（F1，6Pase）被调节的一个实验结果，图中表明在磷酸二羟丙酮（DHAP）增加时，1，6一二磷酸果糖（F1，6P）和2，6一二磷酸果糖（F2，6P）对F1，6Pase的影响，你能得出如下结论：,F2，6P调节F1，6Pase活性F1，6P调节F1，6Pase活性F1，6P和F2，6P都调节F1，6Pase活性F1，6P和F2，6P都不调节 F1，6Pase活性,单选题,1、这是Stitt研究果糖1，6-双磷酸酯酶（F1，6Pase）被调节的一个实验结果，图中表明在磷酸二羟丙酮（DHAP）增加时，1，6一二磷酸果糖（F1，6P）和2，6一二磷酸果糖（F2，6P）对

9、F1，6Pase的影响，你能得出如下结论：,F2，6P调节F1，6Pase活性F1，6P调节F1，6Pase活性F1，6P和F2，6P都调节F1，6Pase活性F1，6P和F2，6P都不调节 F1，6Pase活性,单选题,在研究C4植物蔗糖合成时，测得如下结果：,蔗糖是高等植物生长发育中主要运输物质，它由尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和FP首先形成磷酸蔗糖，也可由UDPG与果糖形成蔗糖。你再由光合碳代谢的知识，得出如下结论：蔗糖只在叶肉细胞中合成 蔗糖只在维管束鞘细胞中合成蔗糖在两类细胞中都能合成 蔗糖不在两类细胞中合成,单选题,在研究C4植物蔗糖合成时，测得如下结果：,蔗糖是高等植物生长发育中

10、主要运输物质，它由尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和FP首先形成磷酸蔗糖，也可由UDPG与果糖形成蔗糖。你再由光合碳代谢的知识，得出如下结论：蔗糖只在叶肉细胞中合成 蔗糖只在维管束鞘细胞中合成蔗糖在两类细胞中都能合成 蔗糖不在两类细胞中合成,单选题,3、在黑暗萌发的芥菜叶子，在萌发60小时用红光诱导20分钟，在72小时时以全黑暗为对照，进行果糖双磷酸酯酶（FBPase）活性测定，结果如下：,在植物中有两种FBPase，一种在叶绿体内，一种在细胞质内，细胞质的酶在pH7.5-8.6之间有相同活性；而叶绿体内的酶只在pH8.6有最大活性，pH7.5时几乎无活性。你认为光诱导的是哪种FBPase。,叶绿

11、体的FBPase 细胞质的FBPase两者都被诱导 两者都没被诱导,单选题,3、在黑暗萌发的芥菜叶子，在萌发60小时用红光诱导20分钟，在72小时时以全黑暗为对照，进行果糖双磷酸酯酶（FBPase）活性测定，结果如下：,在植物中有两种FBPase，一种在叶绿体内，一种在细胞质内，细胞质的酶在pH7.5-8.6之间有相同活性；而叶绿体内的酶只在pH8.6有最大活性，pH7.5时几乎无活性。你认为光诱导的是哪种FBPase。,叶绿体的FBPase 细胞质的FBPase两者都被诱导 两者都没被诱导,单选题,4、光可以诱导一些酶的合成，也可以诱导一些酶的活化。你认为在上题中红光诱导的是哪一种？,酶的合成 酶的活化 酶的合成和活化 都没诱导,单选题,4、光可以诱导一些酶的合成，也可以诱导一些酶的活化。你认为在上题中红光诱导的是哪一种？,酶的合成 酶的活化 酶的合成和活化 都没诱导,限制性内切酶 酶切图谱,DNA指纹图谱,