PCR常见问题、原因分析及其对策.ppt
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1、PCR常见问题、原因分析及其对策,主讲人:欧阳志荃,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,主讲内容,PCR技术简介,PCR标准反应体系,DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物浓度 加量过多导致非特异性扩增增加特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体完整性 避免反复冻融浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则,引 物,扩增产物太少,反应体系对PCR扩增的影响,反应Buffer,pH值,盐离子浓度稳定剂,增强
2、剂,Mg 2浓度,过高非特异性严重过低无扩增产物,dNTP Mixture,浓度适当避免反复冻融,ddH2O,pH值适当避免污染,PCR标准反应体系,DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2 dNTP ddH2O 耐热聚合酶,如何选择最合适的DNA聚合酶,DNA 聚合酶的特性,PCR 实验的不同需求,如何选择最合适的DNA聚合酶 DNA 聚合酶的特性,纯 度,稳定性,酶活性,如何选择最合适的DNA聚合酶 PCR 实验的不同需求,长片段扩增,PCR试剂盒,扩增效率,保 真 性,特 异 性,基因组扩增、RT-PCR,基因筛选、测序、基因克隆,复杂模板扩增(GC含量高、二级结构),构建基因图谱、测序、
3、分子遗传学,复杂模板扩增、大规模基因检测,特异性,热启动 Taq酶,原 理,蜡封 抗体抑制 化学修饰,特 点,避免非特异性扩增 提高PCR反应的,特异性,用 途,基因组扩增 RT-PCR,热启动 Taq酶,特异性,保真性,高保真酶,原 理,用 途,35核酸,表达基因的克隆基因的定点突变 细胞内基因点突变分析(SNP),外切酶活性 降低碱基错配率,保真性,高保真酶,高保真 高扩增效率,原 理,混合酶高扩增效率 35核酸外切,用 途,超长片段扩增,测序,构建基因图谱,复杂模板扩增,GC含量高,二级结构,高保真 高扩增效率,PCR MasterMix,原 理,预配好的PCR反应液 DNA聚合酶 反应
4、缓冲液 dNTP PCR增强剂,PCR Master Mix,特 点,快速简便 减少加样误差和污染 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 特异性强 降低PCR反应的要求,增强特异性 稳定性好 长期放置活性无改变,适用范围,大规模基因检测 目的基因拷贝数极低的样本 GC含量高,有二级结构的模板 复杂基因组样本 可直接检测菌落,基因点突变检测,或者阳性克隆的筛选。,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,PCR常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,PCR常见问题之一,无扩增产物,模板:含有抑制物,含量低B
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