HPV基因分型检测试剂盒常见问题.ppt

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1、HPV基因分型检测项目临床试验实际问题,目 录,试验开展实验室要求HPV临床样本的采集方法及注意事项临床试验操作注意事项临床试验结果分析及常见问题,HPV基因分型检测试验项目 试验开展实验室要求,临床基因扩增实验室设置的一般原则,各区独立注意风向因地制宜方便工作,“十六字方针”,基因扩增检验实验室工作流程,进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序!,最佳的HPV基因分型实验室布局,出口,入口,工作流向,临床样本收集与储存,PCR前区域,PCR后区域,最佳的HPV基因分型实验室布局,每间房间必须有其专用的工作服及一次性手套；每个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材；不同区域的仪器设备及耗材不能混

2、用;,临床样本(原始容器中),样本制备区,试剂准备区,超净工作台,DNA提取,PCR扩增区,导流杂交区,结果通知患者,基础HPV基因分型实验室布局（1）,临床样本(原始容器中),样本制备区,超净工作台,DNA提取,导流杂交区,结果通知患者,PCR区域,基础HPV基因分型实验室布局（2）,每个区域必须有其专用的工作服及一次性手套；每次操作必须更换；涉及到公用仪器使用，必须注意防止交叉污染，定时使用次氯酸钠溶液擦洗；,实验室环境注意事项,工作区域必须始终保持清洁整齐；所有实验台面及地面均应保持清洁；所有实验废料及垃圾使用专用垃圾带装好后，封口处理；在每次工作前后对工作台面进行消毒液（次氯酸溶液）擦

3、洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯进行灭菌；,实验室制度及人员配备,有效的临床结果,严格规章制度并遵守,操作人员具有专业技术知识和经验,强烈责任感工作态度认真细心,严格遵守HPV基因分型各项工作的标准操作规程,实验所需仪器,HybirMax医用核酸分子快速杂交仪,PCR扩增仪,超净工作台,水浴锅,离心机,旋涡混合仪,微量移液器,HPV基因分型检测试验项目 HPV临床样本的采集方法及注意事项,HPV临床样本的采集方法及注意事项,标本收集 标本保存,标本收集,检查前告知病人注意事项：月经正常妇女，在月经来潮后1018天为最佳检查时间。检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道

4、内用药物。检查前48小时最好不要行性生活。检查前不进行醋酸或碘液涂抹。,标本收集,步骤 先脱掉裤子，然后按医生指示仰卧于一张检查床上。,步骤二 由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口采集标本。（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）,标本收集,步骤四 慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。,步骤三 将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈。,标本保存,样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。如若不能马上送检样本，请于4保存，请在2个星期之内进行检测。,标本收集,标准收集中注意

5、事项：使用凯普专用取样器及保存液，可抑制细菌生长，保持DNA完整性。样本收集中为保留足够的宫颈细胞标本，注意切勿将宫颈刷头丢弃。宫颈保存系统包装打开后，必须立即进行采样，并连同刷头置于取样管中。如果同时进行细胞学检查，应先采细胞学样品。宫颈刷头折断、试验取样时，请小心操作，切忌大力震荡取样管，造成试剂及样本溅出影响检测结果或造成污染。取样管上标示的名称须与患者一一对应。取样后，切记拧紧取样管管盖。,HPV基因分型检测试验项目 临床试验操作注意事项,因操作欠规范导致的问题分析,移液器：,严禁大力来回拧动；严禁调至容量之外使用；第二档为排空档，不得作吸取之用；吸头应浸入液面23mm处吸取；严禁将有

6、液体的移液器平放或倒置；混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。,（二）实验室布局不合理引起的污染问题,1、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片 段均会通过空气进行传播。2、PCR结果检测实验室和其它实验室在一 起，会出现严重的扩增子污染。3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公 用，也会造成严重污染。4、实验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯 等）乱 放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室 污染。,（三）PCR操作中存在问题分析,1.阳性变阴性2.阴性变阳性3.PCR结果不稳定,1.阳性变阴性,(1)有些

7、阳性病人，经过PCR检测后为阴性，可能有两种情况：一是采集标本方法或部位不正确，二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。,(2)标本保存不当，可引起PCR失败。收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了PCR检测的模板或造成标本污染。,2.阴性变阳性 常见的原 因有以下5点：,加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染（将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。,打开标本管盖引起样品飞溅（打开前须瞬间离心）操作时手套引起的交叉污染（拿过模板DNA管后应更换手套）,不明

8、原因引起公用试剂污染（必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加）。实验室污染,临床试验操作注意事项,实验室建设方面HPV分型检测试验操作方面 DNA提取 PCR扩增 导流杂交(详见各项操作的SOP）,临床试验操作注意事项 实验室建设方面,一、实验室分独立房间操作:样本储存区（与试剂储存分开）PCR前区域(试剂贮存及准备区,样本处理区)PCR后区域(PCR扩增产物分析区)仪器及耗材独立使用，切忌前后区域交叉！试验工作服及手套独立二、单一工作流程:PCR前区域 PCR后区域三、实验室环境（防止污染、保持清洁整齐、严格制定及执

9、行各项规章）四、试剂管理及标本管理 试剂按要求温度贮存、注意有效期，使用过的试剂拧紧归类放好；样本清楚标记好样本号、与试剂分开贮存，使用过的样本归类放好五、以谨慎的态度对待，并清楚记录实验結果及一些突发性问題；,临床试验操作注意事项 DNA提取,使用移液器吸取临床样本时，避免移液枪头碰到样本管壁。所用移液枪头均为一次性用品，切忌重复使用；,防止造成样本交叉污染,防止造成试剂被污染,正确使用移液器,临床试验操作注意事项 DNA提取,尽可能使用带有滤心的移液器枪头,防止形成气溶胶污染实 验室环境,防止样本DNA污染 移液器枪管,临床试验操作注意事项 DNA提取,DNA提取操作步骤注意事项：加入溶液

10、之前,应确保溶液中没有沉淀出现!以免影响提取效率.加入临床样本时,最好在超净工作台前操作,且将用过的枪头打入到盛有10次氯酸钠的废液瓶中,以免样品交叉污染,影响以后的PCR检测.在煮沸样品时,切记不要让沸水溅入到样品管中!建议水沸腾后调低火力.每次去上清时,尽量去干净,特别是第3步骤,以免影响提取效果.在做PCR之前,最好将提取的样品离心5分钟,取样时尽量不要将枪尖碰到管底的沉淀。,临床试验操作注意事项 PCR扩增,正确使用移液枪,防止造成样本交叉污染,防止造成试剂被污染,临床试验操作注意事项 PCR扩增,尽可能使用带有滤心的长头移液器枪头,防止形成气溶胶,防止样本DNA交叉污染,防止样本污染

11、试剂,临床试验操作注意事项 PCR扩增,防止造成试剂被污染移液枪头均为一次性用品,切忌重复使用移液枪头尽可能为带有滤芯每个区域必须用专用仪器、耗材。进入不同房间必须穿专用工作服及带手套，离开时必须先脱去工作服及手套。PCR后操作区域房间内的所有耗材及仪器均不能与PCR前区域混合使用。使用前后均以次氯酸消毒液清理。,临床试验操作注意事项 PCR扩增,HPV 58,HPV 18,HPV 16,PCR操作不当造成污染：,临床试验操作注意事项 导流杂交,杂交及杂交后清洗溫度（45C）。每次清洗膜后，抽液干净。确保PCR产物变性成功。遵守封阻反应温度及时间、酶标反应时间及显色反应时间，确保杂交结果背景正

12、常。正确使用移液器，移液枪及枪头专用。,HPV基因分型检测试验项目 临床试验结果分析及常见问题,临床试验结果分析及常见问题,HPV阳性正常结果,HPV阴性正常结果,临床试验结果分析及常见问题,一、杂交结果中IC点不清楚，同时阳性点也不清楚或比较淡；可能原因：杂交温度控制不当，出现非特异性杂交点；DNA样本中有对PCR反应的抑制物质，影响了 PCR扩增的效率；确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使 用前再次变性PCR产物。病人样本是否取样前是否违反了取样要求？将DNA样本稀释10倍后，重新PCR扩增及杂交反应可解决。,临床试验结果分析及常见问题,二、杂交结果中，在杂交膜上既无IC点，也没有

13、HPV分型阳性点显色；可能原因：可能是因为DNA模板中存在抑制PCR反应的抑制物质，首先,通过抽提得到的DNA的纯度对PCR反应会有很大影响,所以必 须在做PCR模板的时候将其稀释从而降低DNA溶液中抑制剂的 浓度,使得PCR反应能正常进行，在一家新的医院开始试验的时 候均需要摸索本院样本自身的特点。或者所取样本，不符合凯普HPV分型检测说明书中对样本的 要求，样本之前经过碘染色或者病人使用了阴道冲洗药物，均 会对PCR反应产生抑制。确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使用前再次变 性PCR产物。如果这些情况的时候，建议对样本稀释10倍重新PCR，然后杂交，结果仍然不成功的情况下，建议按

14、照凯普说明书要求重新取样 检测。,临床试验结果分析及常见问题,402721,403022,403040,403078,稀释 1:10 DNA模板重复PCR,临床试验结果分析及常见问题,三、杂交结果中IC点没有，同时阳性点淡或不清楚；可能原因：样本中含有抑制PCR反应的物质；样本中HPV DNA浓度较低，同样本中 含有抑制PCR反应的物质；病人样本不符合凯普分型试验要求，样本本身 为阴性结果，但因为样本中有抑制PCR反应的物 质，同时操作人员对杂交温度又控制不当，出 现非特异性杂交点；建议增加用于扩增DNA浓度，重新PCR扩增及杂交反应。,临床试验结果分析及常见问题,四、IC点弱或者没有，但HP

15、V分型阳性点显色正常可能原因：由于IC和HPV DNA之间存在竞争，高 浓度的HPV DNA可能会对IC点的扩增反 应产生竞争性抑制，此现象出现时如 HPV分型点显色正常，则认为分型结果 正确。,临床试验结果分析及常见问题,六、Biotin（生物素）点不显色可能原因：请确认所使用试剂是否仍在有 效期内。尤其是酶标液及显色 液是否按要求使用及储存。确定实验操作是否严格按照说 明书进行、且试剂是否按要求保 存使用。,临床试验结果分析及常见问题,七、阴性对照显现HPV分型阳性点可能原因：PCR试剂可能被污染，取5 l PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳分析。重复进行PCR及杂交试验,。,临床试验结果

16、分析及常见问题,八、杂交膜有很高的背景可能原因：可能由于封闭不足，使未结合 的酶标残留在膜上。确保封闭液 完全覆盖整个杂交膜。也可能因为没有完全将未结合 的试剂清洗干净，请确保在显色 过程中杂交膜充分清洗，无剩余 残留液体。,临床试验结果分析及常见问题,九、封阻液抽不动 可能原因：仔细观察封阻液是否有絮状微 生物或澄淀，如果有则证明封阻 液有发霉迹象，是由于操作中没 有使用灭菌枪头而造成的。重新购买封阻液，同时确保试验中使用已灭菌的移液枪头,临床试验结果分析及常见问题,十、什么时候需要做阳性及阴性对照 当一个新的医院，一个新的地方开展试验的时候，或更换试验地点的时候，需要进行阴阳性对照试验；当

17、使用的检测试剂批次改变的时候需要做1次阴阳性对照；当杂交结果出现令人疑惑，比如多个样本的杂交结果一样，或者杂交结果出现过多的多重感染，以及杂交试验后出现许多无IC点及阳性杂交点的结果等情况下，需要使用同批试剂进行阴阳性对照试验以验证问题所在；,临床试验结果分析及常见问题,十一、导流杂交试验中的污染主要会出现在那一步中，应该怎样防范？首先，污染情况主要由PCR操作中样本DNA的交叉而产生；对于此种情况，应严格按照SOP操作，确保PCR加样的试验器材均为专用，特别是移液枪和枪头。其次，杂交结果中出现的比较弱的杂交点不是污染造成，而是杂交温度不符合要求而造成的非特异性点。对于此种情况，应在杂交操作的

18、时候，确保杂交液的45条件，以及杂交仪的温度是否符合说明要求的误差范围显示。最终结果如果出现杂交点较弱的情况(肉眼很难看出)，此点可以不用判读。,临床试验结果分析及常见问题,HPV 58,HPV 18,HPV 16,PCR操作不当造成污染：,HPV 34,弱 IC,HPV(-),电泳阳性,其他HPV亚型,临床试验结果分析及常见问题,十二、HPV杂交结果为阴性，但电泳结果为阳性可能原因：PCR产物变性操作失败。导流杂交操作失败。电泳所检测到的HPV DNA不包含在凯普试剂 盒所能检测到的21种亚型内，此种情况较少。,临床试验结果分析及常见问题,十三、杂交后的杂交膜没有形成均一的杂交边缘，而且出现同一次杂交结果互相污染的现象。可能原因：在放分隔膜的时候没有放好，没有形成每个样本独立的杂交 间，所以出现了杂交膜之间的互渗、反渗以及下渗现象；验证方法：在进行预杂交的时候，首先要将杂交膜上的残留溶液全部抽干净，然后先将杂交液加入不相邻的几个杂交孔中，观察其他几孔杂交膜12分钟后，如果杂交膜没有出现润湿或者杂交膜表面出现水珠现象（注意杂交膜边缘），则可以继续试验。预杂交结束后，开泵将预杂交液完全抽干，然后继续开着泵抽12分钟，关泵，等待12分钟，再加PCR产物及杂交液，将会减少反渗现象。,分隔室有渗漏,临床试验结果分析及常见问题,谢谢！,