DNA重组技术的基本步骤.ppt

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1、1.2 基因工程的基本操作程序,目的基因的检测与鉴定,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质.,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶

2、沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列.包括启动子和终止子,2.真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,转录,mRNA前体,加工,翻译,肽链,启动子,终止子,成熟mRNA,能够编码蛋白质的序列。,不能够编码蛋白质的序列。,外显子:,内含子:,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编

3、码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,阅读与思考,1、什么是目的基因？2、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？,请阅读P9第一和二两段,1、目的基因概念：主要指的是编码蛋白质的结构基因。也可以是一些具有调控作用的因子。2、目的基因获取方法：、从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、化学方法直接人工合成,一、目的基因的获取,、从基因文库

4、中获取目的基因,基因文库,基因组文库,部分基因文库,基因文库的构建过程,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库。,基因组文库,cDNA文库的构建-反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),基因文库的构建过程,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,怎样从基因文库

5、中得到我们所需的目的基因呢?,如何从基因文库中找到所需要的基因？,依据-目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。,构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA,目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,

6、、利用PCR技术扩增目的基因,PCR的全称：聚合酶链式反应PCR的原理：DNA复制 PCR技术扩增目的基因的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。,选修3、P58,模板原料引物 酶控制温度,利用PCR技术扩增目的基因,目的基因DNA,四种脱氧核苷酸,如单链DNA分子片段，使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,PCR仪自动调控,PCR的条件：,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补

7、的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,加热至95摄氏度的目的是使DNA中的 断裂，这一过程在细胞内是通过 的作用来完成的。当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料 是，遵循的原则是。Taq酶的特点是（）A.耐强酸 B.耐强碱 C.耐高温 D.最适温度37摄氏度4.请指出PCR技术与DNA复制过程的区别,解旋酶,C,脱氧核苷酸,碱基互补配对原则,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、

8、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋变复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等,用化学方法直接人工合成,条件：,基因较小，核苷酸序列已知。,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,人工合成法（真核生物）,推测,推测,单链DNA,合成,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取从受体

9、细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A.B.C.D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,3、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个,A.540 B.8100 C.17280 D.7560,4、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模

10、板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温A BC D,D,5、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B C D,D,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_ _切断目的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,二、基因表达载体的构建核心,质

11、粒,目的基因,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,2、基因表达载体的组成,目的基因启动子:终止子:标记基因等,一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的首端。,一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的尾端。,启动子的作用：,终止子作用：,使转录在所需要的地方停止。,标记基因作用：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。,是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,3、基因表达载体的构建目的：,a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。b.使目的基因

12、能够表达和发挥作用。,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存

13、在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A BC D,（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A

14、目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,D,下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,1、什么是转化？2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？,三、目的基因导入受体细胞,转化,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞

15、内维持稳定和表达的过程。,三、目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌真核生物：酵母菌和动植物细胞,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,1.目的基因导入植物细胞,常用的方法:农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法,农杆菌的特点:,c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,b.具有趋化性。,a.易感染双子叶植物和祼子植物。,（1）、农杆菌转化法,整合到染色体上,转移至受体细胞,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入

16、单子叶植物(如小麦），从理论上说，你认为应该怎么做？,P15-2,思考与探究,因为单子叶植物不能分泌出大量的酚类化合物来吸引农杆菌，向单子叶植物的伤口处喷洒酚类化合物，使用基因枪法及花粉管道法。,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,1、常用于单子叶植物的转化方法,2、特点：成本高,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细

17、胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,.目的基因导入动物细胞,常用的方法:显微注射技术操作程序：,a.先提纯含目的基因的表达载体 b.从雌性动物体内取出卵（受精卵）c.显微注射仪进行显微注射 d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,3.目的基因导入微生物细胞,原核生物的特点:繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。,大肠杆菌的转化过程:,用Ca2+处理细胞 感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子。,增加细胞壁的透性，与细胞膜无关,将目的基因导入受体细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪

18、法,花粉管通道法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理,比较目的基因导入不同细胞的方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca2+处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞A B C D,B,D,1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？3、利用抗体抗原杂交

19、检测的原理是什么？,四、目的基因检测与鉴定,分子杂交技术,抗原抗体杂交,DNA分子杂交技术,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA探针：,用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序

20、列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P15思考与探究,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分子杂交法,方法:,抗原抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质 A B C D,C,2、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：,