DNA重组技术的基本工具(上课用).ppt

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1、专题1 基因工程,1.1 DNA重组技术的基本工具,基本工具：限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,来源：,主要从原核生物中分离纯化出来。,种类：,已从近300种微生物中分离出4000种限制酶。,作用：,1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,磷酸二酯键：,具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，,作用特点：,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,限制酶的识

2、别序列：,EcoRI限制酶的切割：,中轴线,黏性末端,黏性末端,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,中轴线,SmaI限制酶的切割：,平末端,平末端,只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,产生黏性末端或平末端。,限制酶的作用结果：,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原微生物的侵害。限制酶就是细

3、菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：,Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶,2、作用：,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,DNA连接酶与DNA聚合

4、酶是一回事吗？,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,相同点：形成磷酸二酯键,不同点：,1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2）DNA聚合酶需要以一条DNA链为模板；而DNA连接酶不需要模板。,不是一回事。,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,将外源基因送入受体细胞。,(三)基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,载体的作用：,质粒噬菌体的衍生物动植物病

5、毒等,载体的种类：,作为载体的必要条件：,有切割位点供外源DNA片段(基因)插入。能自我复制有遗传标记基因供重组DNA的鉴定和选择。载体DNA必需是安全的不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。载体DNA分子大小应适合以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,质粒：,裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。,质粒：,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。,1）不属于质粒被选为基因载体的理由是（）A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是

6、环状DNA,D,练习,2）有关基因工程的叙述中，正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的载体 C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与目的基因连接 D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键,C,3.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是 A B C D,答案：D,、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中,答案：C,.（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是 A、基因工程技术

7、能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体,答案：BD,思考与探究 P7,2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,3、天然的DNA分子可以直接用做 基因工程载体吗？为什么？,提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独

8、立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他

9、生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,