DNA和蛋白质技术wang.ppt

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1、DNA和蛋白质技术,知识目标1、通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。2、理解DNA粗提取与鉴定的原理。能力目标掌握DNA粗提取及鉴定方法，能利用DNA的性质进行实验设计和操作。态度观念目标通过对DNA的粗提取的实验过程的设计及操作，锻炼科学的思维方法，培养实事求是的科学态度。,1、提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2、提取DNA的基本思路,利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分,一.提取DNA的方法,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度

2、不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,一.提取DNA的方法,1.在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？2.如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低 在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增

3、大,二.实验设计,（一）实验材料的选取,1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,二.实验设计,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细

4、胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA,植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜.,2、植物细胞,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,二.实验设计,二.实验设计,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,二.实验设计,（三）去除滤

5、液中的杂质,为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?,答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质?,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,二.实验设计,（四）DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。,1、DNA的析出,DNA与二苯胺（沸水浴）会

6、染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,2、DNA的鉴定,三.实验案例,案例：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,提取鸡血细胞的细胞核物质,溶解细胞核内的DNA,析出含DNA的粘稠物,滤取含DNA的粘稠物,将DNA的粘稠物再溶解,过滤含有DNA的氯化钠溶液,提取含杂质较少的DNA,DNA的鉴定,操作步骤,提取鸡血细胞的细胞核物质,将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,讨论1.为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化

7、？2.用玻璃棒搅拌有什么意义？3.滤去的是什么物质？得到的是什么？,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至涨破,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L的溶液40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA溶解在溶液中。然后，用放有纱布的漏斗过滤，取其滤液。,析出含DNA的粘稠物,加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注

8、意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时氯化钠为0.14 molL）,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出.,滤取含DNA的粘稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,将DNA的粘稠物再溶解,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取

9、1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,讨论1.为什么要加50mL的冷酒精？2.观察丝状物呈什么颜色？,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,答：白色,DNA的鉴定,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度

10、为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化,讨论1.比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？2.这一鉴定结果说明什么问题？,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,答：提取出的丝状物是DNA,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出”,此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出？分别在哪一步？,两次使用蒸馏水第一次：细胞吸水胀破 第一步第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步,三次过滤第一次：DNA存在于滤液里 第一步第二次：DNA被留在纱布上 第四步第三次：DNA存在于滤液里 第六步,两次析出第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液，含杂质多 第三步第二次：用冷却的95%的酒精 第七步,思考与讨论,