DNA体外重组技术-LXG.ppt

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1、第五章,DNA体外重组技术,概述,一、DNA重组技术相关概念,克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。,克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。,DNA克隆(DNA cloning),应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，又称基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloing)。,“克隆”某

2、一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA(recombinant DNA)。,实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinant DNA technology)，又称基因工程(genetic engineering)。,二、DNA重组技术基本程序,外源DNA的获取,DNA导入受体菌,目的基因与载体的连接,克隆载体的选择与构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,三、DNA重组的基本步骤,+,+,连接,转化、筛选和鉴定阳性克隆,含重组子的阳性克隆,载体,目的基因,分、切、接、转、筛,第一节,DNA体外重

3、组载体的种类与选择,载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞,并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具。,作为基因工程载体所需具备的基本条件：,1.有自身的复制子，能借助自身的复制和调控对携带的目的基因进行复制和增殖。,3.有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应。,2.有多克隆位点(多种酶单一位点)，易于外源DNA分子与载体及重组。,4.表达型载体还应有强启动子、前导序列、增强子等调控元件。,（一）按功能分类,（二）按受体细胞分类,（三）按载体来源分类,一、载体的分类,细菌培养,质粒扩增并表达蛋白质,大肠杆菌,染色质,质粒,定义:细菌染色质以

4、外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。,二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体1.质粒(plasmid),基因克隆的质粒载体具备的特点：,分子相对较小，具有较高的拷贝数含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白 质的合成，非使质粒的拷贝数增加。具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因 或营养代谢基因等。,抗药基因或营养代谢基因,氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码-内酰胺酶，水解amp-内酰胺环使amp失效四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将tet从细胞移出大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落为蓝色。,Ampr,ORI,Tetr,pBR322质粒：一种克隆

5、质粒,ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。,结构：,Ampr,Tetr：,两个抗性基因用于筛选阳性克隆。,Pst I,BamH I：,两个单酶切位点用于插入目的基因,Ampr,LacZ,MCS,pfxBlue:克隆质粒,MCS：Multiple Clonning Site,提供多个单酶切位点用于克隆操作,LacZ:蓝白斑筛选阳性克隆,pUC18/pUC19,pcDNA3：真核细胞表达质粒,Pcmv：,CMV增强子/启动子,驱动目的基因在真核细胞内表达,BGH pA：加尾信号,目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。,（二）噬菌体,A WB DEF Z J att xis N cl cr

6、o O P Q SR,重组区,cos位点,cos 位点,A,R,A,R,EcoRI,目的基因,EcoRI,EcoRI,插入型,置换型,噬菌体作为载体具有两个特点,噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有30%的DNA是噬菌体生长所非必需的。,噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的75%105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。,噬菌体的种类：,Charon系列、gt系列、EMBL系列,（三）粘粒载体（cosmid),质粒序列：复制原点，抗性标志噬菌体：cos粘端序列插入片段长度可以是载体本身长度的7-10倍,（四）酵母人工染色体载体

7、(YAC),质粒pBR322衍生物,酵母基因,着丝粒,端粒,自主复制顺序,复制起点(ori),Ampr基因,组成,用途,构建真核生物基因组DNA文库,第二节,基因工程中常用工具酶,一、限制性核酸内切酶(II型),切分子克隆的手术刀,定义：,由细菌自己产生的一种能识别和切割DNA内部特定序列的一类核酸酶,有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5 端为P，3端为OH。,识别顺序一般为46个碱基，通常为回文结构，即具有180反向重复。如CATATG,(1).产生平头末端(blunt end),Hae,型酶切割双链DNA产生：,一、限制性核酸内切酶,EcoR

8、I,(2).产生粘性末端(sticky end),一、限制性核酸内切酶,酶单位定义：,在适当反应条件下，1h内在50l体系中完全酶解1g特定DNA底物所需酶量，定为1个活性单位。,出售的内切酶几乎均以DNA作底物测其酶活性单位。,星活性:酶切反应条件不能满足最适条件,导致某些酶产生第二活性.,EcoR I*GAATTC,AATT,标准的酶切体系,1gDNA，20l总反应体积，1U酶，推荐的Buffer和温度，反应1h,酶切体系组成,内切酶 根据实验目的选择，保存，使用，稀释（避免失活与污染）DNA底物 纯度，含量反应buffer 严格按产品说明书 高、中、低盐,酶切反应体系的建立：,酶切温度与

9、时间,一般为37,1h,酶切反应过程,容积：20l，50l,酶容积10%,即甘油 5%注意混匀反应终止：三种方法:10mM EDTA 或0.1%SDS;65，20min;酚/氯仿抽提，乙醇沉淀酶切鉴定：琼脂糖凝胶电泳,酶切反应体系的建立：,二、DNA聚合酶,含3种酶活性：,1.大肠杆菌DNA聚合酶I,5 3聚合酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性,催化DNA缺口平移反应,制备DNA探针(5 3外切酶活性)-主要用途DNA序列分析,应用：,二、DNA聚合酶I,2.Klenow片段,随机引物标记法标记探针-主要用途双脱氧末端终止法进行DNA测序cDNA第二链的合成DNA 3突出末端进行末端标

10、记,用途：,(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段，缺5 3外切酶活性),二、DNA聚合酶I,PCR反应-主要用途DNA测序,用途：,3.Taq DNA聚合酶(65kD),耐热，在7075时具有最佳的生物活性，无3 5外切酶活性(无校正功能）,4.反转录酶(Reverse Transcriptase,RT),功能：,以RNA为模板，以带3-OH末端的DNA片段为引物，沿5至3方向合成DNA链。,3AAAAAAUCUGUCCUA5,dNTPMg2+,反转录酶,3AAAAAAUCUGUCCUA5,5TTTTTTTOH 3,AGACAGGAT3,1.RNA指导的DNA聚合酶活性,5TTTTTTT,2.DNA

11、指导的DNA聚合酶活性；RNA酶H(35RNA外切酶)活性.,4.反转录酶,功能：,后者可降解DNA-RNA杂交分子中的RNA,反转录酶缺乏35核酸外切酶活性,故未校正功能,会出现错配.,应用,最主要是将mRNA逆转录为cDNA,三、DNA连接酶(DNA ligase)基因工程的缝纫针,催化双链DNA相邻碱基5P和3-OH间磷酸二酯键形成的酶。,T4噬菌体DNA连接酶-最常用,催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端)5P和3-OH之间形成磷酸二酯键。,主要功能与用途：,催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。,修复双链DNA分子中单链缺口。,三、DNA连接酶(DNA ligase),修复双链

12、DNA分子中单链缺口,并可催化互补粘性末端的连接.主要用于cDNA第二链的合成.,主要功能与用途：,(二)大肠杆菌DNA连接酶,连接粘性末端可代替T4 DNA连接酶.,四、其他修饰酶,功能：,催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3-OH末端。,(一)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),用途：,1.主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。,2.DNA 3末端的同位素标记。,催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5 磷酸基团水解。,用途：,1.在连接反应中去除载体DNA片段5-P，防止载体自我连接.,2.用32P标记5末端时，用此酶去

13、除5-P，再用激酶进行5的 32P标记.,(二)碱性磷酸酶,功能：,(三)多聚核苷酸激酶(四)RNase(五)DNase,第三节目的基因的获得和修饰-分,通过基因组文库分离、筛选基因通过cDNA文库分离、筛选基因应用PCR或RT-PCR获得目的基因人工合成基因,一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因,从原核基因组中制备从真核基因组中制备,二、采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因,获得已知的基因构建RT-PCR文库法并获得未知基因计算机克隆,三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选,基因组文库(genomic library，G文库)用基因克隆的方法保存宿主细胞中的DNA重组分子中的集合

14、,所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列。,分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术,用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。,G文库构建方法：鸟枪法,cDNA文库(cDNA library，C文库)用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。,C文库构建方法：,反转录法合成的cDNA与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的,分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术,C文库的优势与局限性,本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。

15、,缺点：,2.如目的基因DNA序列需通过氨基酸序 列推测，难于保证与天然基因序列一 致，往往导致表达效率大大降低。,使用DNA合成仪,1.只能合成较小片段的DNA,四、化学合成法制备基因片段,第四节,目的基因的载体连接-接，分子克隆的核心,一、PCR产物的克隆策略,（一）限制性内切酶酶切位点添加法（二）T/A克隆法,定向克隆,将外源DNA片段定向插入到载体中的方法,对于双向插入，如为扩增型载体并无影响；如为表达型载体，反向插入则可导致不表达，故一定要保证正向插入,常用方法：双酶切,Nde I,Hind,TA克隆定义,利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在7075活性高)，

16、使PCR产物的3末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3粘性末端含一个T的线性克隆载体中.,常规的克隆方法：,PCR产物,载体,酶切,酶切后PCR产物,酶切后载体,重组分子,连接,不足：,需要酶切,受酶切位点的限制,TA克隆方法(一步PCR克隆),PCR扩增,+,连接,转化,蓝白筛选,校正聚合酶,平端PCR产物,（一）粘性末端连接法,用同一种限制性内切酶酶切,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,适用于插入片段和载体具有相同的粘性末端,高背景(自身环化),多拷贝插入,双向(正、反)插入,单酶切,缺陷,二、外源DNA片段和载体的连接,（二）平头末端连接法,质粒,产生平末端的内切酶,DNA连接酶,

17、产生粘性末端的内切酶,核酸酶S1,目的基因,重组质粒,产生粘性末端的内切酶,核酸酶S1,本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！,（三）人工接头法,用同一种限制性内切酶酶切,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,+,+,DNA连接酶,接头(linker),本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点,（四）同聚物接尾法,DNA连接酶,重组质粒,质粒,目的基因,内切酶,末端转移酶+dGTP,末端转移酶+dCTP,本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点,连接反应：,16，16h,如何实现？,第五节,重组分子的扩增和鉴定,宿主细胞：被导入重组分子的细胞,宿主细胞,原核细胞：大肠杆

18、菌、链霉菌 及枯草杆菌,真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞,一、重组DNA分子导入受体细胞-转,大肠杆菌的转化,转化(transformation),转化原意：细菌细胞的生物学特性由于受纳了外源DNA而发生可遗传的改变。,质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌的过程,转化的关键：感受态细菌的制备,感受态细胞-competent cell,用理化方法人工诱导细胞，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，此时的细菌称。,转化原理及转化、转染程序,大肠杆菌,膨胀成球形,DNA,抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物,细胞表面,细胞吸收,分裂增殖,原理,化学转化法,重组质粒的导入方法,化学法

19、：需感受态细胞电击法：不需感受态细胞,转化程序：,对数生长期的细菌,感受态细菌(4保存24h),重组质粒DNA+细菌,热休克(42,90s),普通培养基温育,涂布于含抗生素的培养基平板,单菌落,基因导入装置(Bio-Rad),噬菌体转染受体细胞,体外包装,在离体条件下，将提取的包装蛋白与带COS位点的DNA混合，产生噬菌体颗粒的过程。,通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程。,转导-transduction,体外包装,噬菌体的头部蛋白,完整的噬菌体颗粒,DNA重组分子,大肠杆菌,体外包装液已商品化,106噬菌斑/gDNA,1034噬菌斑/gDNA,二、重组DNA分子的鉴

20、定,非转化子,转化子,非重组子,重组子,鉴定,（一）抗生素平板筛选-实为插入失活法,Ampr,Tetr,Kanr,Amps,Tets,Kans,单抗生素筛选,非转化子,转化子,阳性重组子自身环化载体未酶解完全载体非目的基因插入载体,仅作为初步筛选,Ampr,Terr,插入失活的双抗生素对照筛选法,用PstI酶切,DNA连接酶,重组质粒,目的基因,Ampr,Tetr,Pst I,目的基因与pBR322经PstI酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？,思考题,克隆3,5,7,9,10 是阳性克隆,Tet,转化子非转化子(不能生长),插入失活筛选法(120),（二）X-gal筛选-蓝/白筛选,见于pU

21、C系列，pEGM系列，M13,-半乳糖苷酶基因来源-Lac操纵子,LacZ调节序列,载体中,编码-半乳糖苷酶N-末端146个AA序列,IPTG诱导,宿主编码的-半乳糖苷酶缺陷型基因,+,-半乳糖苷酶,Ampr,MCS,LacZ,在Laz中插入目的基因,X-gal,蓝色化合物,-半乳糖苷酶,Lac-Z基因,蓝白斑筛选,阳性克隆,阴性克隆,互补筛选法（237）,(三）酶切电泳鉴定,琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶酶切鉴定,快速小量提取质粒DNA,跑得慢-重组质粒,跑得快-空载体,以本人课题为例,重组CK2 亚基转化子的筛选第2,6,8,10,11,13号克隆是阳性克隆;第1,3,4,5,7,9,12号

22、是阴性克隆,重组CK2 亚基转化子的筛选 第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆;第4,6,8号是阴性克隆,1.DNA/EcoR I+Hind 2.recombinant plasmid/Nde I+Hind III3.recombinant plasmid/Hind III 4.pT7-7/Hind III,重组质粒的酶切鉴定,（四）序列分析,以重组DNA为模板，按两侧引物进行PCR,可扩增插入片段,可直接进行DNA序列分析,对于表达型重组子，插入片段必需是正确的序列，一般要进行DNA测序,以本人课题为例,ABI PRISM 310型 DNA测序仪,主要用于DNA序

23、列分析(包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等,美国PE公司,95.8万元,PE 377型 DNA测序仪,PE 3700型DNA测序仪,克隆的人蛋白激酶 CK2cDNA重组质粒中插入片段DNA测序结果,pTCKA1测序结果 Codon 25 GATGAC,AspAsppTCKA2测序结果 完全正确pTCKA3测序结果 Codon 52 GAAGAG，GluGlupTCKA4测序结果 完全正确,（五）其他方法,内切酶,重组DNA,目的基因,分离,电泳,印迹到NC膜,探针,放射性,非放射性,分子杂交,核酸分子杂交,覆盖滤膜,取下沾有菌落的滤膜,裂解、变性、固定等,与探针杂交,放射性自显影,1 2 3,4 5 6,3和5是阳性克隆,菌落或噬菌斑原位杂交,菌落印迹杂交(603),SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and its Western blot,免疫化学检测（western blot),用已知的特异抗体检测目的基因蛋白,SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and its Western blot,