乙肝两对半检测中(南京).ppt
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1、乙肝两对半免疫学检测相关问题研讨,中山三院检验科李林,HBV感染的实验室检测是目前国内最为常见的检验项目,也是医患纠纷产生较多的领域之一。卫生部临床检验中心 李金明乙肝两对半:HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。检测结果:定性、半定量、定量。试剂原材料:抗原(天然抗原、重组抗原)、抗体(单抗、多抗、Fab)。检测技术:ELISA、化学发光、时间分辨荧光、免疫层析等。检测方法:夹心法(一步法,两步法),竞争法(固相液相竞争法,液相液相竞争法等)。,一、HBsAg方法:双抗体夹心法:两步法,一步法。试剂原材料:HBsAb(McAb、PcAb)或其酶解产物 Fab。,双抗体夹
2、心法模式:,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,HBsAg抗原表位1、共同决定簇:a(aa124-147);2、型特异决定簇:(1)d/y(aa122,赖氨酸/精氨酸);(2)w/r(aa160,赖氨酸/精氨酸);四种亚型:adr、adw、ayr、ayw。,检测中常见的问题,1、一步法测定中的钩状效应(Hook effect):,一步法检测时,受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及标记抗体结合,而不能形成“固相抗体抗原标记抗体”夹心复合物。此时反应后的检测信号位于抗原过剩带上,与标准曲线位于抗体过剩带上的某一抗原浓度的检测信号相同,如按抗体过剩带上的检测信号测读,所得结果将低于实际的含量,
3、这种现象称为钩状效应。钩状效应严重时,可出现假阴性结果。,双抗体夹心一步法的钩状效应(示意图):,固相载体,固相Ab,Ag,标记Ab,钩状效应时分析浓度与检测信号关系图:,检测信号,抗体过剩带,抗原过剩带,抗原分析浓度,HBsAg检测试剂原材料与钩状反应的关系:原材料:HBsAb。多克隆抗体:免疫动物或直接从感染者血清中所获得,来源于不同的B细胞克隆,可含有针对同一抗原分子不同的抗原表位(a、d/y、w/r)的多种定向抗体。单克隆抗体:由一株B细胞杂交瘤产生的只针对某一特定的抗原表位的高度均一,高度专一性的抗体。,McAb制备的试剂受钩状效应的影响较PcAb为轻:,Ig的一个Fab片段只能与一
4、个抗原表位结合。McAb为针对同一抗原表位的均一抗体分子群。HBsAg分子虽具有三个不同的表位(a、d/y、r/w),但一分子HBsAg同样的表位只有一个,只能封闭一个单体McAb的一个抗原位点,两分子抗原才能封闭一个McAb单体。而PcAb为针对同一抗原不同表位抗体分子群(抗a、抗d/y、抗w/r),一分子HBsAg上不同的表位可同时与针对不同表位的两个以上单体PcAb结合,其封闭作用的效率高于对McAb。,McAb试剂的钩状效应,固相载体,McAb(抗a),Ag,标记McAb(抗d),PcAb试剂的钩状效应,固相载体,McAb(抗a),标记McAb(抗r),标记McAb(抗d),钩状效应是
5、HBsAg一步法检测时不可避免的现象;由于钩状效应的存在,一步法检测HBsAg所得到的检测信号无法确定其真实性;解决勾状效应的根本方法为固相抗体与抗原反应后分离游离抗原,再加标记抗体的两步法检测:第一步:包被抗体捕获抗原成为固相,然后分离游离抗原;第二步:固相抗原与标记抗体结合,分离液相标记抗体后记录检测信号。,两步法检测:,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,两步法检测时目的检测物浓度和检测信号关系曲线,检测信号,分析浓度,易误解为两步法的一步法检测:1、标本生物素化抗体标记抗体生物素化抗体抗原标记抗体复合物;2、加入亲和素包被的固相载体固相生物素化抗体抗原标记抗体复物;3、洗涤,判读结果。,2
6、)人抗鼠抗体效应(Human anti-mouse effect,HAMA效应)对检测的干扰,产生HAMA的原因:,经常接触老鼠;肿瘤病人进行鼠单克隆抗体的治疗。,用鼠源McAb检测HBsAg时,如样品中有 HAMA,就会产生假阳性或假阴性。,非鼠源的PcAb可消除HAMA效应,IgFab(Fab)可消除HAMA引起的假阳性。,HAMA效应的假阳性模式:标本中的人抗鼠抗体分别与固相HBsAb和标记HBsAb McAb结合,形成固相HBsAbHAMAHBsAb复合物(双抗原夹心),提供假阳性检测信号。,固相载体,固相McAb,标记McAb,人抗鼠抗体,Human Anti-Mouse Antib
7、odies(HAMA),HAMA效应的假阴性模式:,Figure 3-6 How HAMA generates a false negative,3)S基因突变引起的HBsAg漏检:,基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个氨基酸置换、缺失或插入,HBsAg 蛋白质氨基酸组成发生改变,导致其抗原性产生变化。变异率高,自然变异和免疫逃避,变异无地域性。HBsAg抗原性发生改变,不能被野生型HBsAb所识别。此时用一般的国产试剂盒可能检不出。,能导致HBsAg阴性的S区变异 145甘氨酸 精氨酸 aa124 半胱氨酸 酪氨酸 aa129 谷氨酸 天冬氨酸 aa131 苏氨酸 天冬氨酸 aa131 蛋
8、氨酸 苏氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失 不一定HBsAg抗原性发生改变后就一定漏检。很多时候野生型与突变型是混合存在的,这种情况虽然有突变,同样可以检出。,4)RF引起的假阳性 RF是一种自身抗体,能和多种动物IgG的Fc段结合。由于固相抗体和标记抗体均为IgG,双抗体夹心法测抗原可能有RF的干扰,产生假阳性。,固相载体,固相IgG,标记IgG,RF,解决办法:用IgG的Fab 或F(ab)片段作酶结合物替代完整的IgG;标本用联有热变性IgG的固相吸附剂(G蛋白)处理;将热变性IgG加入到标本稀释液中;离心分离IgM和IgG;加入羊抗人IgG。鼠源单克隆抗体对RF
9、的亲和力较低,也能明显地降低RF对结果的干扰。,McAb和PcAb在HBsAg检测中的应用,McAb:优点:在一步法检测中能减轻钩状效应;便 于人为处理和质量控制。缺点:HAMA效应,灵敏度比不上PcAb。,PcAb:优点:免疫反应性好于McAb,作为标记抗体,PcAb可能提供更强的检测信号,达到更高 的灵敏度;非鼠源PcAb 无HAMA效应。缺点:一步法检测时钩状效应明显。,固相载体,HBsAg McAb(“a”),HBsAg McAb(“a”),标记McAb(抗“d”),标记PcAb(抗“r”),McAb和PcAb在检测HBsAg(adr)时抗原抗体结合示意图,标记PcAb(抗“d”),H
10、BsAg,标记McAb(抗“d”),上述情况是指只采用一种McAb的情况,如果采用两种针对不同表位的McAb,可以提高灵敏度,但同时也和PcAb一样,会发生明显的钩状效应。,常见HBsAg检测情况:ELISA检测模式:一步法。原材料:McAb;检测结果:定性。缺点:钩状效应,灵敏度较差,HAMA干扰、RF干扰,不能定量。化学发光检测模式:一步法。原材料:McAb(Fab);检测结果:定量。灵敏度好于ELISA,无RF干扰。缺点:钩状效应,HAMA干扰,定量结果不能溯源到国际标准。,Abbott检测模式:两步法。原材料:McAb(固相捕获抗体),PcAb(Fab,标记抗体);检测结果:定量。优点
11、:1)无钩状效应;2)无HAMA、无RF干扰;3)灵敏度高;4)加用了针对不同突变株病毒抗原的检测抗体,可以进行HBsAg突变株的检测;5)定量结果可溯源到国际标准。时间分辨荧光检测模式:两步法。原材料:McAb(固相捕获抗体),PcAb(标记抗体);检测结果:定量。特点:无钩状效应;灵敏度高;无HAMA干扰。不能进行HBsAg突变株的检测,可能有RF干扰,定量结果不能溯源到国际标准。,目前国际上常用的HBsAg标准物质:Paul Ehrlich Institute 参考物:PEI/ml;法国参考物:ng/ml;雅培参考物:ng/ml(Axsym),IU/ml(i2000);NIBSC参考物:
12、IU/ml.(英国国家生物标准与检定所,National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)1 IU/ml=0.58PEI/ml=1.93“法国”ng/ml=5.59雅培ng/ml,二、HBsAb 原材料:HBsAg1、天然HBsAg:血源的纯HBsAg,即S蛋白(小球形颗粒);,HBsAg小球型颗粒(2022nm)Dane颗粒(40 42nm)管型颗粒,2、基因工程重组抗原(rHBsAg)。,HBsAb为分别针对HBsAg五种表位(a、d/y、w/r)的不同抗体,其中90%的HBsAb为针对“a”的抗体,为最重要的保护性
13、体,对不同亚型感染均有保护作用(但交叉免疫不完全),也是HBsAb各种抗体中最重要的血清标志物。用于检测HBsAb的抗原,无论天然抗原或重组抗原,必须具有“a”表位,一般为ad、ay亚性联合应用。HBsAb试剂原材料质量优良,检测方法为双抗原夹心法,定量定性检测的结果均准确可靠。,可能出现的问题:如包被物和酶标记物均使用血源球形颗粒,在提取过程中混入Dane颗粒会影响检测结果的特异性。原因:Dane颗粒核心结构中的HBcAg暴露;HBcAg降解为HBeAg抗原。,乙型肝炎病毒(Dane颗粒)结构模式,L蛋白,M蛋白,S蛋白,C蛋白,Dane颗粒暴露的HBcAg和降解生成HBeAg在制备的试剂中
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