酶分子工程概述.ppt
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1、第六章 酶的分子工程,之一:概述,第一节 酶的分子工程,原因:1 稳定性不够,不能适应大量生产 的需要。2 作用的最适条件不符。3 酶的主要动力学性质的不适应。4 临床应用的特殊要求。5.。,酶的分子工程 molecular engineering of the enzyme 主要指化学或分子生物学方法对酶分子进行改造,洗衣粉:枯草芽孢杆菌蛋白酶加强去污能力,在漂白剂的作用下易失去活性。Met-222被氧化将酶蛋白分子中的氨基酸(Met-222)进行替代,使酶的抗氧化能力大大提高,因而可与漂白剂同时使用。,分两部分:对天然酶分子进行改造,包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等分
2、子生物学水平,即用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造,以获得化学结构更为合理的酶蛋白,1、化学酶工程,又称为初级酶工程(Primary enzyme engineering),它主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成,通过化学修饰、固定化处理、甚至通过化学合成法等手段,改善酶的性质以提高催化效率及降低成本。,它包括:自然酶化学修饰酶固定化酶化学人工酶等等的研究和应用。,2.生物酶工程:,是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合一门新兴的生物工程,亦称高级酶工程(Advanced Enzyme Engineering)。,生物酶工程:,克隆酶突变酶新酶,基因工程基本过程,克隆
3、酶,20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达摆脱对天然酶的依赖。,“基因工程发酵工艺先进的发酵设备”酶工业的重大飞跃,最成功的例子:人纤维蛋白溶酶原激活剂促进溶解血块中的纤维蛋白。临床上用于治疗血栓性疾病,促进体内血栓的溶解。利用工程菌株生产的纤维蛋白溶酶原激活剂在疗效上与人体合成的酶完全一效,目前已用于临床试验。凝乳蛋白酶生产乳酪的必需用酶,其来源有限。人们克隆了小牛凝乳酶基因在酵母系统中表达,得到的凝乳酶与从小牛胃中提取的天然酶性质完全一致。,突变酶,定向进化示意图,随机突变+定向选择目标突变体,超自然的优质酶,新酶,T
4、his image shows a computer-generated model for the design of a new enzyme not found in nature.This particular protein design,called retro-aldolase 22,was tested and was able to enhance the rate of a carbon bond breaking chemical reaction 10,000 times over the rate of the uncatalyzed reaction.,Being
5、able to break carbon bonds more quickly and efficiently could lead to improvements in cleaning up organic waste and in developing renewable energy sources,Images by Lin Jiang and Eric Althoff,University of Washington and Howard Hughes Medical Institute.,the designed active site(grey meshing),第二节 酶蛋白
6、的稳定性和稳定化,酶的稳定性(enzyme stability),是指酶分子抵抗各种不利因素影响,维持一定空间结构,保持生物活性相对稳定的能力。在细胞内,酶分子受到内膜系统保护,而且处于还原性环境,不易被氧化失活。而酶工程所涉及的催化过程几乎都在体外,条件比细胞内环境恶劣得多,酶不稳定的缺点显得尤其突出。,稳定的空间结构是酶催化活性稳定的基础从分子水平上看一级结构:肽键和二硫键。酶分子空间结构通常比一级结构更为脆弱,非共价键包括疏水键、氢键、离子键、范德华力、金属离子结合等。,一、蛋白质稳定性的分子原因,蛋白质稳定性的分子原因:,A:金属离子、底物、辅助因子和其他相对分子质量配体的结合作用,金
7、属离子由于结合到多肽链的不稳定部分(特别是弯曲处),因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其它低分子量配体相互作用时,也会看到蛋白质稳定性的增加。这是因为蛋白质与上述效应子的作用常使蛋白质发生构象变化,使其构象更稳定。,B:蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用,当蛋白质形成复合物时,脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上,因而防止疏水簇与溶剂的接触,屏蔽了蛋白质表面的疏水区域,在体内,蛋白质常与脂类或多糖相互作用,形成复合物,从而显著增加蛋白质稳定性。这是因为蛋白质分子表面上既有疏水簇,也有极性和带电基团。从热力学上看,疏水簇与水的接触对蛋白质稳定性是不利的。当蛋白质形成复合物时,脂分子或
8、蛋白质分子稳定到疏水簇上,因而防止疏水簇与溶剂的接触,屏蔽了蛋白质表面的疏水区域,C:盐键和氢键,数目较少,但对蛋白质稳定性贡献很显著,目前认为:氢键与蛋白质稳定性关系不大,3-磷酸-甘油醛脱氢酶:来源:嗜热脂肪芽孢杆菌 兔肌结构很类似,但嗜热的酶亚基间区域有盐桥协作系统,而嗜温的酶没有。因此嗜热酶的催化活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约20。,D:二硫键,Disulfide bond,大分子的分子内交联可增强其坚实性,并提高其在溶液中的稳定性,在酶分子中引入-SH,或者,用双功能试剂实现分子内交联,也能使蛋白质构象稳定化,引入二硫键,研究发现,在酶蛋白中引入半胱氨酸,从而增加酶蛋白中二
9、硫键的数量可以增加某些酶的稳定性,但不影响酶的活性。Tumnen等报道将Trichoderma reesei的木聚糖酶II的一个-螺旋中的Ser-110和Asp-154分别突变为Cys,从而在110位和154位建立一个二硫键,65时的半衰期从不到1min增加到14min。Wakarchuk等在木聚糖酶分子中引入不影响其活性的二硫键,使其耐热性提高了15。,用二硫键稳定蛋白质的思想来自于聚合物化学。五十年代中期已经证明,大分子的分子内交联可增强其坚实性,并提高其在溶液中的稳定性。稳定化指的是熵性质:由于交联即蛋白质中形成二硫键,伸展蛋白质的熵急剧降低,因而天然蛋白和变性蛋白的自由能间的差别增加。
10、这个稳定化效应值随着肽链中氨基酸数目的增加而增加。类似的,用双功能试剂实现分子内交联,也能使蛋白质构象稳定化,这点我们在后面还会提到。,E:疏水相互作用,对蛋白质的稳定性非常重要增加疏水作用数目是稳定蛋白质的实用方法。降低蛋白质表面的疏水性质;增加蛋白质内部的疏水性。从实验上看,可用定点突变或化学修饰来实现这个目的。,F:对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低,结构上重要的氨基酸残基(如活性部位氨基酸)的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环,对氧化特别敏感因此,这些不稳定氨基酸的数目,在高度稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显著偏低,MAPK 磷酸酶(MPKs)
11、削弱应激激活的MAPK 信号传递。MPK含有一个半胱氨酸巯基(sulfhydryl group),决定其催化活性。如果该基团在活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)下发生氧化,MPK活性不可逆地消失,G:氨基酸残基的坚实装配,蛋白质结构中仍有空隙,通常为水分子所充满。分子量为23万的蛋白质中约有个515水分子,会导致蛋白质不稳定。,因此,蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法,溶液中的蛋白质似乎装配紧密,其紧密程度类似于低分子量化合物的晶体状态。尽管如此,蛋白质结构中仍有空隙。按照Chothia说法,蛋白球体积的大约25%仍未充满,即不是被氨基酸占据。但溶质分
12、子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充满。由布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触当然会导致蛋白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去,蛋白质结构变得更坚实,蛋白质的稳定性也增加。因此,蛋白质的坚实化可作为一种人为稳定蛋白质的方法。,蛋白质稳定性因素,金属离子、底物、辅因子和其它低分子质量配体的结合使蛋白质构象稳定;蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用;盐键;疏水相互作用;氢键;二硫键;对氧化修饰敏感的氨基酸含量降低;氨基酸残基的坚实装配。,二、蛋白质不可逆失活的原理和机理,酶在使用和贮存过程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的结果。蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质
13、底物也是一种蛋白水解酶时,就会发生自我降解现象,叫作自溶,1.蛋白水解酶和自溶作用,2.聚合作用,聚合很久以来就被认为是蛋白质失活的一种机理。首先,单分子(N)构象变化,导致蛋白质可逆变性(U)。使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。其次,这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合(A),以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。最后,如果蛋白质当中含cys,形成二硫键(As)当然,聚合作用不一定是不可逆的:用变性剂破坏非共价力(氢键或疏水键)还原或氧化再生二硫键,可使蛋白质活化。,聚合很久以来就被认为是蛋白质失活的一种机理。大约100年前,科学家就发现,加热蛋白水溶液会形成沉淀。聚合分三步进行
14、:N U A As其中N U代表可逆伸展,A是聚合的蛋白质,As是发生了二硫交换反应的蛋白质聚合物。首先,必须发生单分子构象变化,导致蛋白质可逆变性。这个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。其次,这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合,以最大限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。最后,如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基,则会发生分子间二硫交换反应。与许多其它蛋白质失活原因不同,聚合并不一定是不可逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力(氢键或疏水相互作用),在去除变性剂时,通过还原和再氧化再生天然二硫键,则有可能使蛋白质再活化。,注意:聚合和简单的沉淀作用是有区别的。简单的沉淀:蛋白质并
15、未发生显著的构象变化即从溶液中析出。因此,沉淀很易再溶于水溶液中,并恢复其全部天然特性,就象结晶蛋白和冻干蛋白质那样。,3.极端pH,极端pH能启动改变、交联或破坏氨基酸残基的化学反应,结果引起不可逆失活。远离蛋白质的等电点,蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展。但这些构象变化常能导致不可逆聚合;对蛋白酶来说,常导致自溶,肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下发生。6 mol/L HCl,24h,110:蛋白质可完全水解成氨基酸。在Asp所处的肽键在不太酸的环境下短时间也易水解(尤其是Asp-Pro)。Asn和Gln的脱胺作用,会导致蛋白质的疏水性内部引进入负电荷
16、,使得酶失活,食品加工时,蛋白质一般要暴露于碱性条件,发生各种各样的反应,其中包括肽键水解、脱胺、精氨酸水解成鸟氨酸、-消除和外消旋化、双键形成、氨基酸残基破坏和形成新的氨基酸。,4.氧化作用,各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧,H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。,H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下,它主要把蛋氨酸氧化成它的亚砜。虽然蛋氨酸亚砜在体内可被酶、在体外可被巯基化合物还原,但这个反应限制了酶在工业上的应用和贮存。在生物系统中,蛋白质的氧化失活是通过活性氧(OH、O2、H2O2、OCI-)来完成的。例如,中性白细胞可以产生高浓度的氧化
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