血红蛋白的提取与分离(优质课).ppt

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1、课题3 血红蛋白的提取和分离,思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便

2、于提取血红蛋白。,一、基础知识：,凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流

3、动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,缓冲溶液：,2、作用：能够抵制（）的对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,PH值,3、缓冲溶液的配制,通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH2PO4/Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸缓冲液，目

4、的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考：蛋白质为什么带有电荷？,在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷,电泳：,影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离,

5、在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电,1、原理：,聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,测定（）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,2、常见方法,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素,原理,SDS作用,为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS,SDS所带

6、负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小,十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量,应用,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。,SDS,单条肽链

7、的分子量,分子的大小,电泳检测PCR结果,二 实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,1.样品处理,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐磷脂葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞（最多）,血红蛋白（）,两个a肽链,两个一肽链,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,共四条肽链,90,目的：去除（）方法：（）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（），将下层（）的红细胞液体倒入（）,每个肽链环绕（），此基团可携带（）。血红蛋白因含有（）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。,一个亚铁血红素基团,一分子

8、氧或一分子二氧化碳,血红素,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,烧杯,再加入用（）的（）质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤低速离心（低速短时间）,重复4、5步骤（）次，直至上清液中已没有（），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。,五倍体积,生理盐水,三,黄色,(2)血红蛋白的释放,加（）到（）体积，再加40体积的（）（溶解细胞膜），置于（）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白.,(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层:,原血液,甲苯,磁力搅拌器,蒸

9、馏水,第1层（最上层）：（）甲苯层,第2层（中上层）：（）的沉淀层，（）色薄层固体,第3层（中下层）：（）的水溶液层（）的液体,第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层,无色透明,脂溶性物质,白,血红蛋白,红色透明,暗红色,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,取()ml的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（）中，pH为（），透析12小时，目的是（）或用于更换样品中的（）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。,除去样品中分子量较小的杂质,透析袋,磷酸缓冲液,7.0,缓冲液,(4)透析,1,2.凝胶色谱

10、制作,1）凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（），在0.5ml的（）头部切下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。,凹穴,移液管,5cm,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,c.剪尼龙网小圆片覆盖在（）上，用（）的尼龙纱将橡皮塞（）包好，插到玻璃管一端。d、色谱柱下端用移液头部做（），连接一细的（），并用螺旋夹控制尼龙管

11、的（），另一端放入收集（）的收集器内,橡皮塞的凹面,100目,上部,出口部位,尼龙管,打开与关闭,色谱流出液,安装其他附属结构。,顶塞的制作：,插入安装了玻璃管的橡皮塞,组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。,2）凝胶色谱柱填料的处理,（1）凝胶的选择：（）（G-75）“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水7.5克。,（2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成（）。,蒸馏水,凝胶悬浮液,交联葡聚糖凝胶,固定：将色谱柱处置固定在支架上,装填：将（）一次性的缓慢倒入（）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装

12、均匀。,（3）凝胶色谱柱的装填方法,凝胶悬浮液,色谱柱,注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（）12小时。,洗涤平衡,注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。,50cm,3）样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口,

13、缓冲液,凝胶面,加透析样品,调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用（）将1ml（）的样品加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：（）洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：待（）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集,注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面 贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动,吸管,透析液,顶端,样品完全进凝胶层,5ml,红色的蛋白质,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,思考,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通

14、过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。,思考,样品的粗分离,纯化,纯度鉴定,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。,纯化,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度,（1）试剂的配制,丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液,十二烷基硫酸钠（SDS）用去离子水配成10%的贮存液，于室温

15、保存。,用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液,TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。,用去离子水配制10%过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。,Tris甘氨酸电泳缓冲液 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸(pH 8.3)，0.1%的SDS。,样品处理液 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。,染色液 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸脱色液

16、10%的甲醇和10%的冰醋酸。,SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备,1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板,2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备,用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。,（2）电泳方法步骤,配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.

17、67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。,分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。,3）样品处理,5)加样,在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3 min，以使蛋白质变性。,按顺序加样，加样量通常为1025 L。样品可以多加几个，例如，血浆样

18、品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品,4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。,7）剥胶,从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。,8）染色,将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。,6)电泳 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。,10)观察结果：,

19、SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。,9)脱色：染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三 实验结果分析与评价,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观

20、察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,讨论：如何测定蛋白质的分子量？,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售,