蛋白质的共价结构.ppt

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1、蛋白质的共价结构,第 二 章,Structure of Protein,第 二 章 蛋白质的共价结构,第一节、蛋白质通论(P157)第二节、肽第三节、蛋白质一级结构的测定第四节、蛋白质的氨基酸序列与生物功能第五节、肽和蛋白质的人工合成(不要求),第一节、蛋白质通论,一、蛋白质的化学组成和分类二、蛋白质分子的形状和大小三、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次四、蛋白质功能的多样性,一、蛋白质的化学组成和分类,1、化学组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳 50-55%

2、氢 氧 19-24 氮 16%硫 0-3 其他 微 量,蛋白质的含氮量,大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量=蛋白氮 6.256.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数）,1/16%,2、分类(了解)：*根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质：只含氨基酸如清蛋白、谷蛋白、组蛋白、精蛋白等 结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分*根据蛋白质结构分 单体蛋白：仅有一条多肽链构成的蛋白质。寡聚(多聚)蛋白：由2条或多条多肽链构成的蛋白质*根据蛋白质生

3、物学功能分 酶、调节蛋白、转运蛋白、结构蛋白等等,二、蛋白质分子的形状和大小,1、根据蛋白质的形状和溶解度分为：,纤维状Pro：分子类似纤维或细棒，线性结构，在生物体内主要起结构作用，大多不 溶于水和稀盐。球状Pro：近球状结构，疏水aa侧链在分子内部 亲水侧链在外因此溶解性较好，能形 成结晶，大多数蛋白质属于这一类。膜Pr：与细胞中各种膜系统结合而存在。组成特 点是所含的疏水aa较多，不溶于水但 溶于去污剂溶液。,(了解),2、蛋白质分子的大小蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da）或更大。某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称

4、寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。（TMV：4x107）对于那些不含辅基的简单蛋白质，用110除它的分子量可以粗略的估计其氨基酸残基的数目。蛋白质的20种氨基酸的平均分子量是138，但在大多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此平均分子量接近128。因形成一个肽键脱掉一个水分子，故氨基酸残基的平均分子量是110。,三、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次,每种天然蛋白质都有自己特有的空间（三维）结构，这种结构就是蛋白质的构象。构型：是由于化合物分子中某一不对称碳原子上四种不同的取代基团（或原子）的空间排列所形成的一种光学活性立体结构。一个不对称碳原子只能形成两种不同的构型，分子

5、从一种构型变成另一种构型，必须发生共价键的断裂。构象：构象是分子内所有原子或原子团的空间排布所形成的一种立体结构。天然蛋白质分子都有与其生物活性相关的一种或少数几种特定的构象，这种天然构象相当稳定。一个给定的蛋白质理论上可采取多种构象，但在生理条件下一般只有一种或很少几种。,为了表示蛋白质结构的不同组织层次，一般采用这样的专门术语：蛋白质的4级结构(掌握)：P160一级结构指多肽链中的氨基酸的组成和排列顺序。二级结构是指蛋白质多肽链主链借助氢键排列成自己特有的-螺旋和-折叠片段。二级结构仅仅是主链构象，不讨论侧链基团的空间排布。三级结构指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状

6、构象。四级结构指两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成的蛋白质空间结构-即寡聚蛋白，其中每条多肽链形成的独立3级结构单元称为亚基。,虾红素,为 研 究 方 便，分 四层 次 探 讨,四、蛋白质功能的多样性(了解),1.蛋白质是生物 体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,蛋白质种类非常多，原因？蛋白质的生物学功能有以下几方面：1.催化功能-酶2.结构功能-皮毛骨牙细胞骨架3.载运功能-膜蛋白4.调控功能-激素5.运动功能-鞭毛

7、、肌肉蛋白6.防御功能-免疫球蛋白7.神经传导 其他蛋白（受体蛋白、毒素蛋白、激素蛋白等）,蛋白质分布广泛、功能多样,蛋白质的功能与分布单细胞生物,胞外酶鞭毛-蛋白质（运动器官）细胞壁-糖、脂、肽细胞膜-载运蛋白、酶蛋白细胞质-酶蛋白（催化物质代谢）细胞核-酶蛋白（催化遗传）,多细胞动物,个体层次,毛发、皮肤-角蛋白,骨骼、牙齿-钙+胶原蛋白,食道（口、胃、肠）-消化酶（细胞外）血管中-免疫蛋白（Antibody）激素蛋白,器官层次,细胞水平,提问：为什么人体细胞会有不同的形状呢？细胞内有支撑体？,细胞内丝网状骨架蛋白（决定细胞形状及运动）；,地衣细胞,带有绿色荧光的骨架蛋白质,食物酵母细胞,

8、细胞粘连物质-胶原蛋白细胞膜载体蛋白细胞质(包括细胞器)酶（物质代谢）、信号传递细胞核酶（遗传）、结构蛋白（染色体骨架）,结构蛋白,均为纤维状；功能 蛋 白,大多为 球 状；,其他组成以及结构复杂程度不同 结构决定功能即分子结构的不同决定其具有不同的生物功能,同样是有20种Aa组成，为何这些蛋白质的功能大不相同？,第二节 肽（peptide）,P162（熟悉）一、肽和肽键的结构二、肽的物化性质三、天然存在的活性肽,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,一、肽与肽键的结构,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的

9、氨基酸单元称为氨基酸残基。,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽键（peptide bond）：,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。,0.125nm键长=0.133nm 0.145nm,肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。,肽键有部分双键性质,肽键由于共振而具有部分双键性质，因此，肽键比一般C-N键短，且不能自由旋转 肽键原子及相邻的a碳原子组成肽平面 相邻的a碳原子呈反式构型,肽键比一般C-N键短,肽键为一平面,相邻的a碳原子呈反式构型,两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽由十个以内氨基

10、酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,肽的命名,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln命名为：某氨基酰某氨基酰。某氨基酸通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。,肽链中AA的排列顺序和命名,肽链也像氨基酸一样具有

11、极性，通常总是把NH2末端氨基酸残基放在左边，COOH末端氨基酸残基放在右边。除特别指明者外，上面举例的五肽丝氨酸残基一侧为NH2末端，谷氨酰胺残基一侧为 COOH末端。注意，反过来书写的 GlnAspTyrValSer是与前者不同的另一种五肽。,肽的结构,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,*多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,2.2 肽,多个氨基酸形成的肽叫多肽，呈链状故又称多肽链。蛋白质=1或几条长多肽链+或不+辅助基团 短 链 且具有生物功能的 多 肽 不

12、 算 蛋 白 质，通常称为活性肽！,二、肽的重要理化性质（了解）,1.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。2.在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链上可解离的基团。3.每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA一致且复杂。B2+,B+,B,B-,B2-,K1,K2,K3,K4,pI=pK2+pK3/2,4.原则：当溶液pH大于解离侧链的值，占优 势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液pH小于解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的共轭酸。（P166例子）5.肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、Sanger反应、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩

13、脲反应。,三、天然存在的活性肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽（active peptide）。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,P167，了解,与真核生物的RNA聚合酶和牢固结合,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆

14、菌肽S(环十肽)由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine,缩写为 Orn）。,CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH,CH2,CH2,CHNH2,COOH,CH2,SH,干扰素、胸腺肽是治疗乙肝、肿瘤的首选药机理：由受损细胞分泌促使其他细胞产生相应的抗病毒蛋白质。详见：,脑肽是人在受到突然伤害，脑垂体自然分泌的“鸦片”。有什么生物意义？不受疼痛的干扰，迅速自救,附：几种生物活性肽,1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropep

15、tide),2.多肽类激素及神经肽,第三节、蛋白质一级结构的测定(了解),1.蛋白质一级结构(Primary structure)包括：(1)组成蛋白质的多肽链数目.(2)多肽链的氨基酸顺序，(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,P168,2.蛋白质的一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。(1)测定蛋白质的一级结构的要求A.样品必需纯（97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.

16、测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,蛋白质测序的一般步骤,样品要求：纯度，均一，知道分子量（1）测定Pro分子中多肽链的数目，根据N末端和C末端的数量。（2）拆分蛋白质分子的多肽链（3）断开多肽链内的二硫键，一般用甲酸氧化或巯基化合物还原。（4）分析每一多肽链的氨基酸组成，一部分样品完全水解，测定氨基酸组成，并计算氨基酸成分的分子比。,（5）鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基，建立两个氨基酸序列的参考点。（6）断裂多肽链为较小的片段（7）测定各肽段的氨基酸序列，目前常用Edman降解法。（8）根据上述个肽段的氨基酸序列测定结果，利

17、用两套或几套肽段的序列彼此间的交错重叠，可拼凑出整条多肽链的氨基酸序列。（9）确定二硫键的位置。,(2)测定步骤测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。N-AA or C-AA=pro 单链蛋白N-AA or C-AA=X pro 多链蛋白若末端AA多于一种，蛋白质由两条或多条不同的多肽链组成。,多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).二硫键的断裂：

18、几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,巯基的保护,测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；分析多肽链的N-末端和C-末端 末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：,二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲

19、氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键

20、速度最大。羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。羧肽酶A+B：除Pro外的所有C端AA;羧肽酶Y：所有C端AA,多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法有：,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶(P174，考研的掌握)化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,测定每个肽段的氨基酸顺序。确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。(P179)确定原多肽链中二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,3、蛋白质测序举例(P180),第四节、蛋白质的氨基酸序列与生物功能（见第四章）第五节、肽和蛋白质的人工合成(自己看),