结核病的实验室诊断技术及应用.ppt

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1、结核病实验室诊断技术及应用,全球范围内结核病疫情急剧恶化 全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌，人口的大规模流动 结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐多药菌株的出现我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国 患病率高，新发患者93万/年，结核菌感染率为约40 死亡率高，每年死亡人数达13万 耐药率高早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素 常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60。摘自2014年中国结核病监测报告,结核病检测技术发展历程,灵敏度低检测周期长成本低,交叉污染仪器要求复杂反应抑制,高灵敏度高特异性交叉污染少,血清学检测WHO不推荐r-干扰素释放实验,结核病检测技术发展历程

2、,一、细菌法 直接涂片（阳性率低5000以上细菌/ml；不能区分真假、死活）,一、细菌法 结核菌的培养,结核病病原学诊断的金标准(培养时间长是其软肋),一、细菌学检测的新方法提高阳性率,发光二极管荧光显微镜（LED）液体培养（可同时缩短培养时间）自动化涂片/染色技术（夹层杯法）,不能区分真假、死活；培养仍是金标准但耗时长、,分枝杆菌固体培养与液体培养比较,液体培养在提高阳性率、缩短报阳时间上均优于固体培养。,吴学兵，陆彬，桂晓虹等。液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估。检验医学，2013,3（28）：211-214,仍然不能满足临床快速诊断的需要,二、免疫学检测,血清学检测（抗体、

3、抗原）结核菌素试验（灵敏度、特异性？）结核感染T细胞检测（-干扰素检测）,WHO关于血清学检测声明,2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）正式声明，要求禁止将 血清学检测方法（抗原，抗体，蛋白芯片等）用于肺结核和肺外结核的诊断。,WHO warns against the use of inaccurate commercialserological tests for pulmonary and extra-pulmonaryTB.,蛋白质组学的发展 3、4、7种结核杆菌优势表位抗原（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、Mtb16.3）制备

4、多靶点蛋白微阵列 大量的文献报道其敏感性特异性均显著高于涂片与培养法 可用于结核病的临床辅助诊断，提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率,参考文献略,-干扰素释放实验（IGRAs),10,Interferon-Gamma Release Assays,结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10,由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失RD1和RD2绝大多数的环境分枝杆菌(NTM)也不存在RD1和RD2区,11,ESAT-6:早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6）CFP10:培养滤液蛋白10（Culture Filtrate

5、 Protein 10）,12,结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10,准确T-SPOT临床诊断性能,特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655),13,T-SPOT相关指南,T-SPOT.TB是采用-干扰素释放试验（IGRA）原理，获得美国FDA认证、欧盟CE认证和首个中国CFDA认证的

6、商业化产品列入欧美25个国家结核诊疗指南 2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、2010年加拿大结核指南美国CDC推荐卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选 国内风湿科和消化科已列入专家共识,14,快速T-SPOT的实验步骤,15,实验效果图,一个斑点=一个结核效应淋巴细胞,T-SPOT结果的解读-阳性结果,活动性结核病 典型结核中毒症状 影像学支持 排除其他诊断MTB感染状态 典型结核中毒症状 未发现结核患病证据,潜伏性结核感染 无结核中毒症状 无其它结核患病证据陈旧性结核 无结核中毒症状 既往TB史或明确TB证据,NTM（四种）感染,高孟秋，-干扰素释放试验检测结果

7、的临床意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014,T-SPOT结果解读-阴性结果,除外结核感染 所用抗原为MTB特异性抗原 机体没有结核特异抗原致敏的T淋巴细胞 目前未感染结核分枝杆菌,假阴性：感染阶段不同（窗口期）少数免疫系统功能不全/基础疾病的情况，如HIV感染者、肿瘤患者、婴幼儿等特殊肺外结核：结核性脑膜炎、粟粒性结核灵敏度相对较低实验非正常操作：细胞计数不够等,高孟秋，-干扰素释放试验检测结果的临床意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014,T-SPOT的应用,优点：使用血液标本，取样简单；可用于肺内和肺外结核检测；阴性预测值很高，可用于排除结核感染。缺点：阳性预测值约80%，不能用于结核的确

8、诊 不能确定是否是肺结核（肺外）不能区分是活动性和潜伏性结核不能区分某些非结核分枝杆菌（堪萨斯、苏氏、戈登、海 分枝杆菌）操作复杂，时间长；对于原发感染初期或免疫低下人群，可能存在假阴性。,能否疗效监测？无大量数据,三、结核DNA检测技术,测序金标准荧光定量 PCR环介导恒温扩增法（LAMP）基因芯片检测鉴定技术基因Xpert MTB/RIF检测技术,1.荧光定量 PCR,是应用最为广泛的TB-DNA定量PCR检测方法具有灵敏度高（10CFU/ml）、特异性强、线性关系好、操作简单等优点。,2.环介导恒温扩增法（LAMP）,是在恒温下进行PCR扩增，因此操作更为简便，反应更加快速。65扩增40

9、min即可用肉眼观察结果。扩增阳性标本呈现绿色荧光，反之为阴性。是结核分枝杆菌DNA检测技术的代表-灵敏、快速、特异、简捷将会极大地推动结核病的防治工作,DNA检测-LAMP,结果判读：显色目测或SYBR Green I等荧光染料,LAMP法和其他PCR法的比较,LAMP法在结核菌检测中的应用,临床试验,LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果,灵敏度89.54%阳性结果预期值98.13%特异性98.93%阴性结果预期值93.77%总符合率95.31%,26,Journal of Clinical Microbiology.2010,48(10):36543660.,通量：可同时检测 16

10、-22种常见分枝杆菌速度：6小时 灵敏度：103 CFU/ml可自动或肉眼判读结果,3.基因芯片检测技术,检测全程仅需6小时,同时鉴定MTC与21种NTM,4.Xpert MTB/RIF检测技术,GeneXpert应用1、TB复合群鉴定。2、利福平耐药检测。3、WHO推荐4、XpertMTB/RIF检测试剂的阳性检出率低于人们对分子生物学诊断试剂高敏感度的预期值，（1000CFU/ml）,DNA用于临床检验的不足,“死菌检测呈阳性”，与临床相关性差不能区分“潜伏感染”“活动性感染”易交叉污染 反应易受抑制,NASBA（国外）TMA（国外）SAT（国内）,四、常见的RNA检测技术,SAT技术是将

11、核酸恒温扩增和实时荧光 检测相结合的一种新型RNA检测技术。,TBSAT 检测技术,TB-SAT操作流程,50 l 稀释液,全程2小时，会做PCR，就学的会SAT,TB-SAT检测技术优点,RNA诊断技术的优势,灵敏度高：RNA DNA拷贝数与临床相关性好：区分“死活菌”：减少抗生素滥用可以诊断“活动性感染”：活动性感染：RNA转录活跃 潜伏感染：RNA不转录不易污染：靶标和扩增产物都是RNA,TB-SAT检测区分MTB和NTM,结核分枝杆菌复合群（MTB）：人型结核分枝杆菌牛型结核分枝杆菌非洲型结核分枝杆菌,非结核分枝杆菌（NTM）：研究表明，TB-SAT可以区分如下NTM：堪萨斯分枝杆菌、

12、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、海分枝杆菌等18种,Novel Real-Time Simultaneous Amplification and Testing Method To Accurately and Rapidly Detect Mycobacterium tuberculosis Complex J.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.,活菌检测技术，可用作肺结核治疗效果评估,据文献报道：每个结核分枝杆菌含有约2000个拷贝rRNA研究表明：rRNA与结核分枝杆菌的生活力有着很好的相关性，rRNA可

13、以反映结核分枝杆菌的死菌活菌状态研究表明：在用药治疗期内，随着结核分枝杆菌的死亡，rRNA大约在7天左右时间全部降解。而DNA含量几乎保持不变,VIVIAN JONAS,et al.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Sept.1993,p.2410-2416CLAUDIO PIERSIMONI,et al.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.1997,p.193196.GABRIELLE M.E.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,Sept.1994,p.1959-1965,免疫法常有

14、既往感染问题,SAT更有利于治愈判断,窗口期,时间示意,相对浓度示意,抗体,RNA,DNA,病原体感染前后各检测靶标的含量变化,死菌的RNA快速降解，有助治愈判断,用药治疗,DNA需要一段时间降解,RNA快速降解,相比DNA,RNA检测能更好的体现疗效,服用利福平和氧氟沙星后，第三天和第七天DNA和RNA的滴度变化，相比DNA,RNA与药物浓度变化的符合率更高，RNA检测能更好的进行疗效评估。,GABRIELLE M.E.Assessment of Mycobacterial Viability by RNA Amplification.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHE

15、MOTHERAPY,Sept.1994,p.1959-1965,DNA,RNA,SAT与培养的监测结果一致，可应用于疗效评估,胡永领，刘成永，成松.应用RNA恒温扩增实时荧光检测技术观察抗结核药物的疗效.海峡药学,2015年第27卷第1期,SAT在抗结核治疗药物效果检测方面，虽不能直接作出药物敏感试验，但可以最快地直接判断所用药物的疗效，及时调整药物使用，可大大降低医疗成本和耐药产生的机会，大幅度减少医疗时间和费用。,TB-SAT检测体液、病灶组织标本的灵敏度,蔡杏珊,马品云,张院良，谭耀驹 中国防痨杂志,2014,36(6):458-461,小结,TB-SAT是国内唯一的结核分枝杆菌RNA检

16、测产品，2小时报告结果，可以快速对开放性肺结核患者进行排查。TB-SAT可以区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌，准确鉴别出肺结核患者。中国防痨协会与结核病权威专家推崇TB-SAT用于早期发现传染性肺结核，减少肺结核导致的公共卫生安全问题。,美国CDC关于RNA检测技术在TB诊断的指南,1996：美国首个结核病的RNA检测技术通过FDA认证，配合培养法对涂阳患者进行诊断2000：美国CDC指出RNA检测技术用于TB疑似患者(涂阳、涂阴)痰液检测、DNA检测技术仅用于涂阳患者的痰液检测2009：更新关于分子诊断技术在TB实验室诊断的指南 至少一个痰液样本使用分子诊断技术检测TB实验室初步诊断同

17、时参照分子诊断和涂片的结果,中国结核病诊断专家共识,结核病诊断专家组：庄玉辉、万利亚潘毓瑄、成诗明赵雁林、王国治吴雪琼、万康林周林、许卫国居金良、胡忠义,专家共识：TB-SAT显著提高结核分枝杆菌的阳性检出率，对早期发现传染性肺结核患者，控制结核病传染源有极其重要的意义,中国防痨协会，2012年6月,结核实验室检测方法中推荐SAT,胡忠义.实验结核病学.军事医学科学出版社.2014.赵雁林.结核病实验室检验规程.中国防痨协会.2015,五、耐多药结核病诊断现状,47,固液体培养（时间、生物安全等）,分子生物学技术应用使快速检测耐药成为可能,MDR、XDR的出现对结核病的防控提出了严峻的考验,结

18、核耐药分子诊断技术,测序（金标准-检测突变的理想方法）实时荧光PCR探针溶解曲线法实时PCR技术（Gene Xpert）线性探针杂交（Hain LPA）基因芯片（Gene chip）,48,检测已知的突变位点,耐药分子诊断检测的灵敏度：103CFU/ml,结核病耐药与基因,64-68%rps L 基因突变,70%emb B基因突变,70%,65%,耐药基因,93%,95%,95%rpo B基因突变,利福平,异烟肼,50-70%kat G基因突变5-10%inh A基因突变6-13%ahp C基因启动子区域突变,链霉素,乙胺丁醇,多数研究报告提示：耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因

19、一个或几个核苷酸突变（表现增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合产生耐药,结核耐药分子诊断技术,测序-与标准序列进行比照检测未知的突变位点（金标准-检测突变的理想方法；设备、检测的费用昂贵）实时荧光PCR探针溶解曲线法-检测利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇已知的耐药突变位点-2小时实时PCR技术（Gene Xpert）-实时荧光定量PCR技术检测rpoB基因突变确定利福平耐药性，鉴定是否结核-1小时,50,结核耐药分子诊断技术,线性探针杂交（Hain LPA）-PCR扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，检测rpoB、katG和inhA基因突变位点

20、,诊断利福平和异烟肼耐药性-8小时基因芯片（Gene chip）-可检测四种一线药物（利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇）13种突变位点-6小时,51,核心基因芯片技术,生物素,链霉亲和素-过氧化物酶复合物,:,耐药突变基因鉴定,同时鉴定4种一线药物5个基因13个位点,总结肺结核诊断建议,疑似患者的诊断,阳性,SAT,阴性,确诊结核,T-SPOT,阳性,阴性,80%可能是结核，需其他方法进一步检查,排除结核（原发初始患者免疫力低下，不能排除）需其他方法作为辅助手段,疗效监测：确诊结核患者的用药疗效，1个月或2个月使用SAT判断。培养作 为辅助手段。,上 海 市 结 核（肺）重 点 实 验 室,结 束 语,尽管结核病实验室诊断技术研究已取得很大进展，但各种测定方法仍有诸多不足 实现结核病的精准、快速检验仍然任重而道远,Thanks！,