细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项(实验员).ppt

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2、菌种）液体培养基接种法,病原菌的分离鉴定,细菌分离培养 主要针对性用于临床发病动物组织脏器，粪便中的细菌时对某一种细菌的分离，通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌落特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定。,1.基本条件（1）接种用具：棉签、接种环、接种针、酒精灯（2）培养箱：普通恒温培养箱（3）无菌室和超净工作台（4）培养基：营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂2.接种方法分区划线法用棉签先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三区依次用接种环划线。每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。每一区域的划分应接触线应接触上一区域的接种线23次，使菌量逐渐减少，以形成单个

3、菌落。划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。,（2）液体培养基接种法（增菌法）用棉签或接种环挑取病料或菌落，在试管壁和液面交界处轻轻研磨，使菌团混匀在液体培养基中。（3）倾注平板法 主要用于水质（饮水）的细菌计数 将灭菌生理盐水适量稀释（通常做10-1-10-4稀释）的水质1ml，置灭菌平皿内，注入以灭菌溶化并冷却至50左右的培养基15ml，混匀，待冷却后，倒置。于37恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落数，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。,大肠杆菌细菌分离,黑色带有金属光泽，圆形隆起,粉红色或深红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐；,沙门氏菌细菌分离,圆形、微凸、边缘整

4、齐、直径在12 mm的小菌落，菌落无色透明、淡黄色透明或外周透明中心黑色,蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌株菌落中心带黑色,实验室分离,链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落,巴氏杆菌在血琼脂平板生长为淡灰白色，闪光的露珠状小菌落,形态学检查,染色标本的检查 通过对标本的涂片及染色观察细菌的形态、大小、排列、染色特性，一及荚膜、鞭毛、芽孢、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步识别或诊断。1.涂片：从肉汤或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理盐水的玻片上，涂片厚薄适当。2.固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通过3次，加热固定。3.染色：滴加染液覆盖菌膜。4.脱色：乙醇是最常用的脱色

5、剂，70%乙醇和无机酸脱色能力强。5.复染：复染可使脱色的细菌重新着色。,常用的染色方法 革兰氏染色法：最常用的一种染色方法（1）染色步骤 结晶紫初染：结晶紫染色1.5min，水洗，甩干 碘液媒染：碘液染色2min，水洗，甩干 酒精脱色：95%乙醇脱色，2030s，脱色到无结晶紫为止，水洗，甩干 石碳酸复红复染：石碳酸复红染色1.5min，水洗，吸水纸吸干。（2）结果 革兰氏阳性蓝紫色，革兰氏阴性紫红色。,大肠杆菌形态鉴定,沙门氏菌形态鉴定,巴氏杆菌形态鉴定,链球菌形态鉴定,葡萄球菌形态鉴定,病原菌的生化鉴定,糖类发酵试验原理：不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖能力不同，产生代谢物不同，看细

6、菌是否分解各类糖，是否产酸产气。葡萄糖代谢类型鉴别试验原理：又称氧化/发酵试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧（氧化性），还是无氧酵解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱性）三糖铁试验原理：三糖铁用于观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生硫化氢，可初步鉴定细菌的菌属。,生化鉴定,细菌对药物的敏感性试验,抗菌药物敏感性试验（AST，药敏试验）用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。,方法：扩散法（纸片法）稀释法（琼脂稀释法和液体稀释法）,快速药敏试验：由病料直接涂布药敏试验与病原菌分离同时进行（16-24h），可根据

7、药敏结果初步进行治疗。前增菌法药敏试验：挑取组织培养后菌落，放于灭菌肉汤培养液中，涂抹进行药敏实验8-12h后观察结果。传统法药敏试验：耗时较长（2-3天），对于一般养殖场定期监测病原菌及其敏感性时，可以使用此方法。能较好地分离出病原菌，病原菌经纯培养后，进行药敏试验，得出的数据可以准确反应出病原菌对某一药物的敏感性。,试验方法,（1）样品处理：用灭菌棉签沾取组织内部，然后打开装有增菌液（营养肉汤）的管子，使增菌液与棉签充分混匀，盖上盖子，做好标记，放入恒温箱中37培养12-24小时，此肉汤菌液为前增菌液。（2）细菌分离培养：待取出装有沾取病变组织灭菌棉签的试管，观察营养肉汤中的细菌变混浊。若

8、变混浊，用接种环挑取菌液，无菌操作划线接种于麦康凯琼脂、SS琼脂，37培养12-24h，观察是否有细菌生长，初步判定感染病原菌的类型。,操作过程,前增菌药敏试验,（3）涂板、贴纸片：用灭菌棉签沾取稀释的培养液，在管壁清碰几下，挤掉多余水分，均匀涂抹于营养琼脂平板上，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀，并贴上药敏纸片，37倒置培养 8-18h，观察结果。,操作过程,（4）结果观察、判定标准,抑菌圈：用游标卡尺从平板背面精确测量各个抑菌圈直径（精确到0.01mm），抑菌圈的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。原料药判定按抗微生物药物敏感性试验执行标准2010成品药判定标准：20 mm 极敏 15-20 mm 高敏 10-14 mm 中敏 10 mm 不敏 选药原则：敏感而价格低的药，实际的运用过程中应交叉给药，以减少耐药菌株的产生,细菌学实验操作注意事项,1、无菌观念要加强，双重保护很重要。2、发病前期好时机，最好三两混合取。3、细菌分离常练习，分离手法越熟练。4、染色三不过 涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。5、药敏实验方法多，选取最佳很重要。,谢谢,