细胞化学与组织化.ppt

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1、细胞化学与组织化学实验须知,1自觉遵守课堂纪律,维持课堂秩序,不迟到、不 早退,保持整洁、安静、有序的实验环境。2认真预习实验课内容熟悉实验目的、原理和方 法，了解所需使用仪器。3实验台面保持整洁，书包等物品按规定放置整 齐，仪器、药品摆放整齐、有序，公用试剂用毕,物归原处。地面及水池内不得乱丢废物。4使用药品、试剂和各种药品注意节约，爱护器 材。洗涤和使用仪器时应仔细，防止损坏仪器。严格遵守 仪操作规程，在未知正确操作程序时，不要独自使用，须在老师的指导下进行。,5实验废弃物、毒害性实验材料应倾倒在指定地点，统一处置。6实验时一律穿工作服，不允许穿拖鞋进实验室，以免溅落的腐蚀性药品或掉下的玻

2、璃器皿伤及裸露的皮肤。7节约水、电、气，燃气灯应随用随关。最后离开实验室时，要将室内检查一遍，关好水、电、气，锁好门窗。8实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁携出室外。借物必须办登记手续。9实验结束，将实验记录交指导教师审阅并做好室内清洁工作。,实验报告格式,实验(编号)(实验名称)1.实验目的和要求2.实验内容3.实验原理4.实验操作方法(或步骤)5.实验结果与分析,实验一细胞内碱性蛋白的显示-组蛋白的显示,南昌大学生命科学学院 主讲:范 丽 华,一、实验目的,掌握细胞内碱性蛋白的鉴别方法并了解碱性 蛋白在细胞内的分布。学会制作血涂片并掌握制作技巧。,二、实验原理,由于不同的蛋白质分

3、子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。,三、实验用品,1材料 鲫鱼2试剂 1)carnoy固定液(无水乙醇：氯仿：冰醋酸按6：3：1配制)一次配制1L.2)0.1%碱性坚牢绿染液：取0.1 g坚牢绿加入100毫升蒸馏水，再加少量0.1M NaoH 调节pH至8.0-8.1.3)5%三氯醋酸 4)70%乙醇 5)香柏油3器材 解剖盘，注射器，载玻片，显微镜,

4、水浴锅等。,四、实验方法,1将鲫鱼放入盘中，尾静脉取血,滴一滴血在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。2.将涂片作好标记放在现配制的Carnoy固定液中固定10分钟，室温晾干。3放入现配制的5三氯醋酸中90(10-15分钟)，抽提出核酸。4.将玻片放在70%乙醇中5-10分钟清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。5滤纸吸干玻片上水分。6.一张片放入0.1碱性固绿(pH8.08.1)中染色1520分钟。7清水冲洗（3分钟），盖上盖片镜检。,对照片,不进入5三氯醋酸中抽提出核酸。其他步骤同上。.,五、实验中注意事项,(1)用5%TCA提取DNA是该实验中的关键。DNA

5、必须被提取，以使染色质的负电荷下降，用热TCA提取核酸后，酸性染料（固绿）在碱性pH下，碱性蛋白可以选择性地被染色，如未被提取，不能染色，或整个切片染成蓝绿色，水洗或进入酒精即褪色。(2)染液pH必须高（pH8.08.1），从而使其他蛋白质染色极微。,六、血涂片的制作,.取一滴鲫鱼新鲜的血液，置于玻片的一端，以左手拿该片的两端，迅速用右手拿住另一载玻片的一端，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片。.室温下自然晾干。待晾干后进入到固定液中进行固定。注意：在制作血涂片的过程中要用力均匀，避免来回推拉及刮片好的血涂片在显微镜下观察到

6、的细胞应成单层均匀排列。,人血涂片,七、相关理论知识,家畜血涂片。低倍镜下观察可见大量圆形而细小的红细胞。白细胞很少，稀疏地散布于红细胞之间，选白细胞较多的部位（一般在血膜边缘和血膜尾部，因体积大的细胞常在此出现）。红细胞:呈圆盘状,边缘厚,中间薄,无核。中性粒细胞:是白细胞中较多的一种,体积比红细胞大,核呈杆状(为幼稚型,胞核细长,弯曲盘绕成马蹄形,S形,W形或U形等多种形态)或分叶状,一般分35叶或更多，跟该细胞年龄有关。淋巴细胞：有大中小三种类型，其中小淋巴细胞最多，血膜上很易看到，体积与红细胞相近具核，核大而圆大淋巴细胞在正常细胞中不常见到，体积与单核细胞相近或略小，胞核圆形，胞质较小

7、淋巴细胞多。,嗜酸性粒细胞：比中性粒细胞略大，数量少，胞核常分两叶嗜碱性粒细胞：数量很少体积与嗜酸性粒细胞相近或略小胞核呈形或双叶状单核细胞：是白细胞中体积最大的一种，胞核呈肾形，马蹄形或不规则形细胞质丰富血小板：体积小，常三五成群散布在红细胞中家禽血涂片鸡血的有形成分与其他家畜比较有以下不同:）红细胞，呈椭圆形，中央有一椭圆形的细胞核）中性粒细胞，又称嗜性粒细胞，圆形，有25个分叶核）凝血细胞，又称血栓细胞，相当于其他家畜的血小板；凝血细胞具有典型细胞形态和结构，比红细胞稍小，两端钝圆，核呈椭圆形染色质致密其他细胞与家畜的血细胞相似,人血涂片,3.鱼类血涂片）红细胞，呈椭圆形，中央有一椭圆形

8、的细胞核）中性粒细胞，又称嗜性粒细胞，圆形，有25个分叶核）凝血细胞，又称血栓细胞，相当于其他家畜的血小板；凝血细胞具有典型细胞形态和结构，比红细胞稍小，两端钝圆，核呈椭圆形染色质致密其他细胞与家畜的血细胞相似,成熟红细胞,血栓细胞,鱼血细胞图,大淋巴细胞,淋巴细胞,小淋巴细胞,嗜 中 性 粒 细 胞,单 核 细 胞,八、实验结果,经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色,细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。,九、思考题,1.细胞内碱性蛋白显示的基本原理?2.制作一张好的血涂片应掌握什么技巧?3.家禽,家畜及鱼类的血细胞有何区别?

9、,十、实验报告要求,1.绘制自制血涂片中的各种血细胞。2.示意出细胞中的碱性蛋白（组蛋白）的分布。3.在每类细胞正下方标注该细胞名称及放大倍率，并注明细胞膜，细胞质，核膜，用实心小圆点示 意碱性蛋白的分布。颜色用文字说明，禁用彩笔 描绘。,实验二、细胞中酸性磷酸酶的定位,南昌大学生命科学学院 范 丽 华,一、实验目的,1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤。2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。,二、实验原理,酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，其能分解磷酸酯而释放出磷酸基。在PH5.0的酸性环境中，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅

10、沉淀，由此能显示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。反应如下：-甘油磷酸钠-甘油+PO4 3-PO43-+Pb(NO3)2-Pb3(PO4)2（沉淀）Pb3(PO4)2+(NH4)2S-PbS(棕黑色),二、实验原理,酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，主要存在于巨嗜细胞,定位于溶酶体内。正常条件下,巨嗜细胞处于休止状态,酶活性很低。但在合适的pH条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现出一系列显著的变化，如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增强，从而改变其渗透性底物可以渗入，酶活力被显示。,反应如下：,-甘油磷酸钠-甘油+PO4 3-PO43-+Pb(NO3)2-Pb3(PO4)2（沉淀）Pb3(

11、PO4)2+(NH4)2S-PbS(棕黑色),通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅沉淀物。但因其是无色的，需再经过与硫化铵作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。,三、实验材料、试剂和仪器,1.材料 小白鼠2.试剂1)甲醛钙固定液：甲醛10ml,10%氯化钙 10ml,蒸馏水80毫升。2)酸性磷酸酶作用液:称取硝酸铅25mg,加0.05mol/L乙酸缓冲液22.5ml,搅动使之全部溶解后,再缓慢地滴加3%-甘油磷酸钠液2.5ml,边加边搅动防止产生沉淀,总量25ml.(现配制,不能储存)。3)2硫

12、化铵溶液：硫酸铵2毫升98毫升水。4)0.05molL乙酸缓冲液。,A液（0.2mol/L乙酸液）：冰醋酸1.2ml加蒸馏水100ml。B液（0.2mol/L乙酸钠液）：NaAc.3H2O2.72g加蒸馏水至00毫升。取A液毫升B液70毫升蒸馏水300毫升。6)6%淀粉肉汤:牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g,NaCl 0.5g,可溶性淀粉.0g，蒸馏水00ml，煮沸灭菌，保存，使用时热水浴融化。3.仪器、用具：注射器、恒温水箱、显微镜、擦镜纸、解剖盘、解剖剪、盖玻片、吸水纸。,四、实验方法与步骤,.前处理（）小白鼠每日腹腔注射淀粉肉汤ml，连续注射天（）在第h,再向腹腔注射ml生理盐水，过min

13、用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，吸取腹腔液,.制片,1.将腹腔液滴一滴于冰冻的干净载玻片上，涂开，自然干燥。2.放入作用液中，37 保温30min。3.蒸馏水漂洗片刻。4.放入甲醛钙固定液中固定5min。5.蒸馏水漂洗片刻。6.放入2%硫化铵液3-5min。7.蒸馏水漂洗,镜检。3.对照实验:标本放入作用液前先用高温（50）处理30min,使酶失去活性，做好标记，其它步骤同上3-7步。,五、实验中的注意事项,作用液中铅离子的浓度是至关重要的，必须现配现用，当铅离子浓度过低时产生的磷酸离子不能被捕捉而引起弥散，并可进入细胞核内造成细胞核染色的假阳性，孵育时间过长也可发生酶扩散和核染色的现象,六、

14、实验结果与分析,白细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富,整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。,七、实验报告及思考题,简图表示所观察到的酸性磷酸酶显示结果和分布。思考题在制片的过程中为什么要采用冷冻涂片？,实验三 酯酶的显示（Gomori醋酸 a-奈酯法）,南昌大学生命科学学院 范 丽 华,一、实验目的,.掌握非特异性酯酶的显示方法及实验原理。2.观察各类非特异性酶在细胞内的分布。,二、实验原理,非特异性酯酶（nonspecific estarases)广泛分布于动、植物组织内，肝、肾和小肠内活性最强此酶定位于内质网、溶酶体，可能还有线

15、粒体和胞质内酶活性最适pH为其在细胞内的作用尚不清楚非特异性酯酶又根据E600、DFP、PCMB等对它们的抑制作用分为羧酸酯酶（A-酯酶)、芳香酯酶（B-酯酶)、乙酰酯酶(C-酯酶)等本实验以a-醋酸奈酯为底物，经酶水解产生奈酯，立即与坚牢蓝RR盐耦联，形成黑色偶氮染料此酶的酶解和耦联反应进行得非常快，需时很短,三、实验材料及试剂,1.鲫鱼2.试剂配制）PBS pH7.4:Na2HPO4.12H2O 27.2gNaH2PO4.2H2O 3.49g 配成一升溶液）酯酸a-奈酯 0.25g）冷丙酮 6.25ml）坚牢蓝.仪器注射器、显微镜、擦镜纸、解剖盘、吸水纸。,四、实验方法,滴一滴鱼血再涂片，

16、让其自然晾干。在冷丙酮中固定10-15分钟，再在室温下晾干。在作用液中反应10-15分钟。用自来水冲洗2分钟左右。等晾干后在显微镜下观察。对照（1）10-5mol/L二乙基对硝基磷酸盐（E600）或10-4mol/L二异丙氟磷酸(DFP)抑制B-酯酶，不抑制A-酯酶和C-酯酶。（2）10-4mol/L对氯汞甲酸（PCMB）能抑制A-酯酶，却能激活C-酯酶。,五、实验结果与分析,细胞核染成深兰色，酯酶主要存在细胞质中染为棕黑色。在对照组中(1)中细胞质中染为棕黑色,为A-酯酶和C-酯酶存在部位。在对照组中(2)中细胞质中染为棕黑色处为 C-酯酶存在部位。,六、实验报告及思考题,简图表示所观察到的

17、酯酶显示结果和分布。思考题在实验中为什么采用冷丙酮进行固定?,实验四 细胞凝集反应,南昌大学生命科学学院 主讲：范 丽 华,一、实验目的,学习研究细胞凝集反应的方法,了解细胞发生凝集反应的原因.了解颗粒性抗原与可溶性抗原凝集反应的原理.,二、实验原理,凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质，被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。凝集素使细胞凝集是因为它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞发生凝集。大多数凝集素存在于储藏器官中，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时，凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。凝集素与糖结合

18、的活性及专一性决定其功能。,三、相关理论知识,颗粒性凝集反应（agglutination）是一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。,1.直接凝集反应,颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。1)玻片法是一种定性试验方法。可用已知抗体来检测未知抗原。若鉴定新分离的菌种时，可取已知抗体滴加在玻片上，将待检菌液一滴与其混匀。数分种后，如出现肉眼可见的凝集现象，为阳性反应。该法简

19、便快速，除鉴定菌种外，尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。,2)试管法是一种定量试验的经典方法。可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。操作时，将待检血清用生理盐水连续成倍稀释，然后加入等量抗原，最高稀释度仍有凝集现象者，为血清的效价，也称滴度，以表示血清中抗体的相对含量。诊断伤寒、副伤寒病的肥达氏反应（Widaltest）、布氏病的瑞特氏反应（Wright test）均属定量凝集反应。,2.间接凝集反应,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜条

20、件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（O型）和动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接凝集反应高得多。注：可溶性抗原通常为蛋白质,多糖,多肽,核酸.,三、实验用品,材料：马铃薯块茎实验试剂：(1)磷酸缓冲液：分别称取氯化钠7.2g和磷酸氢二钠1.48g，用蒸馏水溶解，混合后用蒸馏水定容至1000ml，调pH值至7.2。(2)2%兔血细胞：以无菌方法抽取兔的静脉血（加肝素抗

21、凝剂）用生理盐水洗5次，每次2000r/min离心5min，最后按红细胞体积加生理盐水配成2%兔血细胞液。(3)生理盐水。实验仪器:捣碎机，离心管，冷冻离心机，载玻片，光学显微镜。,四、实验步骤,(一)细胞凝集反应1.2兔血红细胞悬液制备新鲜兔血加抗凝剂，生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，按红细胞压积用生理盐水配成2兔血红细胞悬液。2.土豆凝集素制备 土豆2克，加10ml PBS，浸泡2h。3.细胞凝集反应土豆凝集素1滴、2兔血红细胞液1滴。载玻片上混匀，静置20min。4.对照PBS1滴、2兔血红细胞液1滴。,鸭 血 红 细 胞(非哺乳类),未凝血,凝血,（二）细胞膜的渗

22、透性1.低渗溶液 1)试管一支：2)兔血红细胞液1ml；3)蒸馏水10ml；结果溶血，溶液变透明。2.等渗溶液 1)0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵 2)0.17mol/L硝酸铵、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸铵、3)0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮等8种溶液进行同样实验，步骤同上。,五、实验结果,实验组发生可视的细胞凝集反应,即红细胞凝集成团。对照组中兔血红细胞经低渗盐溶液处理后,细胞破裂,内容物释放,细胞成透亮的圆形,较正常生理状态下红细胞要亮及大。,六、思考题,1.血红细胞的凝集现象的原理?2.为什么兔血红细胞经低渗盐溶液处理后,还具有圆形结构,并变的透亮?,七、实验报告要求,绘制兔血红细胞图。简图示意细胞的凝集现象。简图示意兔血红细胞低渗下的细胞形态。,实验五 石蜡组织切片的HE染色实验,南昌大学生命科学学院 主讲：范 丽 华,