稳定性同位素讲座.ppt

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1、稳定 性同位素在发酵过程工艺优化研究中的应用,13C MFA,A Powerful Tool in Metabolic Engineering,概念原理实验设计应用,生产过程中广泛存在的问题：1 发酵生产中底物（糖、前体等）消耗较大造成发酵原材料成本较高，如青霉素、头孢、环保菌素、维生素发酵等。2 发酵生产过程中副产物的组分含量较高，如谷氨酸发酵过程中乳酸的积累、维生素B12发酵过程中丙酸积累。3 发酵产物合成途径的分析，初级代谢与次级代谢之 间的关系。4 发酵产物合成过程中，哪些物质或条件能够促进产物的合成，其作用的原理是什么。,基于化学计量学的代谢通量分析（常规MFA）基于化学计量学的MF

2、A即常规MFA，其理论基础是中间代谢物的拟稳态假设和物料的质量守恒定律。它是在构建好的细胞代谢网络的基础上，先假设代谢网络的中间代谢物都处于拟稳态，然后根据物料质量守恒定律写出符合该代谢网络的化学计量矩阵方程，再通过测量胞外底物消耗速率和代谢物分泌速率，最后计算得出整个代谢网络的流量分布。可逆反应、平行反应、无效循环以及回补反应等，严重影响着发酵过程代谢产物的生物合成过程，基于碳标记实验（CLE）的代谢通量分析（13C-MFA）该方法使用某个特定位置被标记的底物分子，或者用部分标记及部分未标记的混合底物培养微生物；细胞摄取标记底物后，经过体内一系列的代谢反应，底物的标记信息在代谢过程中通过中间

3、代谢途径被转移到中间代谢产物上，代谢途径的不同就会引起中间代谢物碳骨架标记碳原子的丰度不同，用GC-MS或NMR可以测量出中间代谢物的标记信息，该信息可以用来进行代谢途径通量的分析；这种方法逐渐得到扩展和修正，已经走向成熟化，成为国际上代谢工程研究和应用的热点。,原理,13C MFA（代谢通量分析）该方法主要基于连续培养的拟稳态，将微生物在有特定标记碳源底物的培养基中培养，标记碳原子就会分布到整个代谢网络，13C标记的底物（通常为葡萄糖）被引入 生 物反应体系中，随着生化反应的发生，经化学重排、化学 键的断裂及新化学键的 生成，13C原子将分布于代谢网络、胞内代谢物及生物量组成之中，直至整个系

4、统处于同位素平衡状态；这时稳态的菌体蛋白水解得到的氨基酸的同位素碳原子的标记丰度可以用NMR或MS进行检测，由氨基酸的标记信息根据同位素的质量分布向量平衡，可以进一步得到中心代谢碳骨架有机酸的标记信息，这些碳原子的同位素标记信息可以用于分析和计算代谢途径的通量信息。这种方法能够对传统代谢流计算中不能分析的双向代谢反应、回补途径和反向代谢途径进行测定。在非稳态过程中进行标记实验时，可通过胞内游离的氨基酸的标记信息来进行代谢流的通量计算。,Figure 5.Network representation of the partial measurements for the medium-size

5、E.coli network(Antoniewicz et al.,2007c).Panel(A)shows the biosynthesis of eachamino acid whose fragment MDVs were measured.Source metabolites are circled,and the measured product(PDO)is boxed by a solid line.Measured amino acids are also boxed by solid lines and their direct carbon sources are indi

6、cated by dotted arrows.Some metabolites(in dotted squares)appear more than once to make the figure more readable.Panel(B)shows the complete set of alternatives for the two partial measurements(22 combinations in total)required in addition to the suggested core measurements.Only amino acid pairs conn

7、ected with a line are valid measurement choices.Color figure can be seen in the online version of this article,available at.,SER,The fractional labeling of each fragment was calculated,实验设计对该菌的代谢途径有一定的了解。合成培养基的选择。标记底物的选择。标记底物 模式的选择。取样时 间点的选择。,应用实例,某发酵过程中甜菜碱代谢作用分析7-ADCA发酵过程中己二酸前体的利用,A 某发酵过程中甜菜碱代谢作用分析,MVAglyt=fMVAglybet+(1-f)MVAser1-2,实验设计：用全标记的葡萄糖和没有标记的天然甜菜碱，批发酵培养，定时取样分析菌体组成氨基酸的标记丰度变化。,7-ADCA发酵过程中己二酸前体的利用,全标记的葡萄糖+天然的己二酸恒化培养，稳态取样,