生物化学技术实验.ppt

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1、生物化学技术实验部分(2010版),生物化学研究的核心任务：阐明生命现象的分子机理。,生物大分子物质制备的基本过程：,确定测定方法材料的选择与处理抽提浓缩纯化有效成分纯度和性质的分析,电 泳,前处理,浓缩、粗分离,细分离,生物组织,无细胞提取液,破碎、溶 解、差速离心、过滤,沉淀法,亲和层析,离子交换层析,精制后的蛋白质,凝胶过滤,吸附层析,蛋白质的制备：,一、蛋白质的性质：,（1）两性解离的性质：pI（2）胶体性质：不能通过半透膜（3）具有沉淀作用：等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等（4）变性、复性（5）紫外吸收,二、分离纯化蛋白质的主要方法,（一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀法 等电

2、点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法,有机溶剂沉淀法,利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法。,降低水活性，使溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间的作用力，因而聚集在一起。,Membrane protein,有机溶剂沉淀法,Water-soluble,protein,Water-solubleprotein,有机溶剂,有机溶液沉淀法的优缺点,优点,分辨力比盐析法高，溶剂易于除去和回收。,缺点,易使某些蛋白质或酶变性。,常用的有机溶剂,乙醇、丙酮丙酮沉淀能力比较强,用有机溶剂沉淀法时应注意的问题,温度的控制有机溶剂的选择pH值的选择离子强度的选择分离溶液浓度的控制及时处理沉淀物,

3、温度的控制,全部操作过程应在低温条件进行，而且最好在同一温度下进行。加入的有机溶剂温度要预冷。,pH值的选择,pH值影响蛋白质在有机溶剂中溶解度，分级沉淀时更应严格控制pH值。应选择pH值在等电点（PI）附近。,离子强度的选择,离子强度达到一定程度时，能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。离子强度0.05mol/L为好，过大则需更多的有机溶剂来沉淀。由盐析法沉淀得到的蛋白质或酶，用有机溶剂沉淀前，一定要先透析除盐。,分离溶液浓度的控制,蛋白质浓度愈大，加入有机溶剂后，蛋白质沉淀量就愈多。蛋白质浓度大时，可减少变性，节省有机溶剂用量。浓度过大，共沉淀现象增加，不利于分级沉淀。,及时处理沉淀物,沉

4、淀物要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。,（二）、根据 分子大小和形状的差异分离,透析和超滤法：除去小分子物质,半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。,施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子,沉降的速度与颗粒的大小和密度有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析,密度梯度离心法,凝胶过滤层析的原理:介质：交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P，）琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）,凝胶过滤法,支持物

5、的选择：,（三）根据电荷性质的差异分离 1、电泳和等电聚焦法：普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳支持物：PAGE、琼脂糖胶等,Polyacrylamide Gel Electrophoresis(PAGE),Molecules are separated by size and charge in an electric field.,Isoelectric Focusing relies on the migration of charged proteins in an electric field,等电聚焦法,2、离子交换层析法 基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂,电荷基团：

6、,阳离子交换剂,（四）配体亲和力的差异：亲和层析 利用生物大分子能和其配体（例：酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体）通过次级键专一性结合，而在一定的条件下又可解离的原理进行层析的方法。用这种层析方法，一次可将物质提得很纯，是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。,亲和层析作用机理：,(1),(2),(3),A,B,Sample,Washing,Elution,亲和吸附剂的制备,分离纯化一定数量的游离配体载体活化配体与载体偶联,Activity,亲和层析图谱：,Protein,pH 2.05,*,（五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatog

7、raphy),HPLC的特点：1.支持介质颗粒细，比表面积大。2.溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。HPLC是一项快速、灵敏、高效的分离技术。,纯化方案的评价,比活力：活力单位数/mg蛋白纯化倍数：每步的比活力/粗抽提液的比活力回收率：每步的总活力/粗提液的总活力 100%,亲和层析纯化胰蛋白酶,手脑并用，知行合一,胰蛋白酶的制备,目前工业上提取胰蛋白酶主要有二种途径：1、从动物胰脏中直接提取。2、从猪胰残渣中提取。,胰蛋白酶的性质,胰蛋白酶在pH3.0时最为稳定，低于此pH时酶易变性；当高于pH5.0以上时，酶易自溶而会失去活性。提取制备胰蛋白酶的全部过程中应注意溶液的pH值以及在冷室（0一5

8、）中进行操作为宜。,胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原先正常生理条件下，可以被肠激酶、钙离子所激活或自我活化成为有活力的酶。,猪胰蛋白酶原分子量为24-25kDa之间，而猪胰蛋白酶原激活后，N-端丢失个6肽，分子量变为23.4kDa，分子构象发生了一定的改变，pI变为10.8。,胰蛋白酶对R1=Arg和Lys肽键具有选择性水解作用，将蛋白质水解为多肽或氨基酸。,由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶不会消化正常组织。在胰脏、鸡蛋清和大豆中，都含有相当量的胰蛋白酶抑制剂。,胰蛋白酶不仅能够水解Arg和Lys羧基所组成的肽键，而且也能水解酰胺键和酯键。对其催化水解活

9、性的敏感度为：酯键酰胺键肽键,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)和弹性蛋白酶三种酶在理化性质和结构上均十分接近，利用一般常用的提取分离方法，很难将它们之间彼此彻底分开。为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采用亲和层折技术进一步纯化后，可达到十分满意的效果。,胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵类粘蛋白(CHOM),CHOM在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂有较高的耐受性，在碱性条件下易变性，在50%的丙酮或者10%三氯醋酸溶液中仍然有较好的溶解度。因此选择合适的pH值、丙酮或三氯醋酸的浓度，可以从鸡蛋清中除去大量的非卵类粘蛋白，从而获得较纯的CHOM。,CHOM的理化性质（分离纯化的依据）,CHO

10、M是一种糖蛋白，存在于鸡蛋清中，是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂。CHOM对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用，而对糜蛋白酶无抑制作用。在pH7.6pH8.0的范围内，猪或牛的胰蛋白酶能牢固地吸附在CHOM上，在的范围内，又能从CHOM上被洗脱下来。,CHOM的性质（作为亲和层析配体纯化胰蛋白酶的依据）,一分子的CHOM能抑制一分子的胰蛋白酶。1mg鸡卵类粘蛋白能抑制0.86mg胰蛋白酶。,采用鸡卵类粘蛋白作为配基合成亲和吸附剂，可以从猪胰脏的粗提液中，通过亲和层析柱直接获得纯度很高的猪胰蛋白酶。比活力常常可以达到15000-20000 BAEE单位/mg蛋白，相当于五次重结晶的胰蛋白酶，纯化

11、效率可提高10-20倍。,亲和层析纯化胰蛋白酶的效果,胰蛋白酶活性的测定及CHOM抑制活性的测定,在任何蛋白质纯化过程中，关键的第一步是建立自始至终都要用的测活方法，这是策略上要作的最重要的决定，测活方法应始终是可信的。,胰蛋白酶除了能水解蛋白质中碱性氨基酸的羧基与其它氨基酸所组成的肽键外，还能水解碱性氨基酸所组成的酯键。胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酯键和酰胺键，而其高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸的羧基一侧的选择。,依 据,底物：N-苯甲酰L一精氨酸乙酯（简称 BAEE）BAEE在胰蛋白酶催化下水解成N-苯甲酰L一精氨酸（简称 BA），BAEE在波长253nm下的紫外光吸收远远

12、弱于BA，随着BA逐渐增多，反应体系在波长253nm下的紫外光吸收亦随之相应增加，用紫外吸收法测定BA的增加，可以作为测定胰蛋白酶活性及鸡卵类粘蛋白抑制活性的专一性方法。,方 法,胰蛋白酶的BAEE单位定义为：在下列实验条件下，引起每分钟光吸收值A253nm增加0.001的酶量。底物（BAEE）浓度为1mmol/L 反应液为0.05mol/L Tris-HCl,pH7.6光程1cm 反应温度25 波长253nm OD值递增0.001/min,1、以鸡蛋清为原料经过提取、分离、纯化等手段得到一个纯度较高的胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵类粘蛋白（简称CHOM），以猪胰脏为原料经过提取、分离、激活等步骤

13、得到胰蛋白酶的粗提液。并且对所得到的鸡卵类粘蛋白和猪胰蛋白酶的含量、纯度及其生物活性进行测定。2、以SEPHAROSE 4B为载体经过活化，偶联合成一个具有专一性的特殊配基-卵类粘蛋白作为亲和吸附剂。3、用自己合成的亲和吸附剂，通过亲和层析技术得到非常纯的猪胰蛋白酶。,实验内容提要,实验流程,1.鸡卵类粘蛋白的制备鸡卵类粘蛋白粗品的制备 鸡卵类粘蛋白粗品的精制,2.亲和吸附剂的合成 载体的活化 配体与载体的偶联 亲和吸附剂的装柱,3.猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶的精制猪胰蛋白酶原的提取 胰蛋白酶原的激活 上亲和层析柱纯化,三大任务,!做明白人，干明白事。先动脑，再动手。！实验无小事，事事不马虎。

14、!实验结果和数据及时保存及处理!保持实验室整洁。,N项注意,*胰蛋白酶标准品的比活力（BAEE单位/mg蛋白）*鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力（BAEE单位/mg蛋白）*胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力（BAEE单位/mg蛋白）*.鸡卵类粘蛋白产率(mg/100ml):100ml鸡蛋清得到鸡卵类粘蛋白的mg数。*.偶联率(mg/g):1g Sepharose 4B偶联鸡卵类粘蛋白的mg数。*.亲和吸附率(mg/g):1g Sepharose 4B结合胰蛋白酶的mg数。*.活性回收率:经亲和层析后的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。*.纯化倍数:亲和层析纯化的胰蛋白酶比活性与上样前的比活性之

15、比。,需要得到的结果,*Sephadex G-25柱层析鸡卵类粘蛋白脱盐的层析图,*DE-32纤维素离子交换柱层析分离鸡卵类粘蛋白的层析图,*绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图,操作步骤,用具清洗和试剂配制,0.02mol/L,pH6.5 磷酸缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液),注意：0.2mol/L是指Na2HPO4和NaH2PO4的总浓度。先配制10倍的母液（0.2mol/L），用时稀释10倍。1、查附录中缓冲液配制表，确定Na2HPO4和 NaH2PO4的比例；2、分别配制0.2mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4溶液；3、按比例混合0.2mol/L Na2HPO4溶液和0.2m

16、ol/L NaH2PO4溶液，直至pH为6.5。,磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（）（25）0.2mol/L磷酸氢二钠：Na2HPO412H2O 71.64g/1,000ml0.2mol/L磷酸二氢钠：NaH2PO42H2O 31.21g/1,000ml,鸡卵类粘蛋白的制备,50毫升鸡蛋清+50毫升10%三氯醋酸的盐溶液，产生白色沉淀，pH应为3.5。,室温静置4小时以上，3000转/分 离心10分钟。上清液用滤纸过滤。pH为3.5。,缓慢加入3倍体积的预冷丙酮。在冰浴中静置4小时。,2、Sephadex G-25凝胶层析脱盐,称取30克Sephadex G-25，用0.02mol/L,pH6.

17、5磷酸缓冲液室温溶胀24小时。,真空脱气后装柱，用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液平衡柱床，直至记录仪绘出稳定基线。,取20毫升鸡卵类粘蛋白粗提液上柱脱盐（上样量不超过柱床体积的1/6），用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液洗脱，收集第一峰。,1.鸡卵类粘蛋白的制备,3、鸡卵类粘蛋白粗品的精制（离子交换纤维素层析）,称取DE-32粉10克，用150ml 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡20分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。,用150ml 0.5mol/L HCl 溶液浸泡20分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。,用150ml 0.02m

18、ol/L,pH6.5的磷酸缓冲液浸泡10分钟，脱气装柱。,将脱盐后的鸡卵类粘蛋白粗提液上柱，以0.02mol/L,pH6.5的磷酸缓冲液洗去杂蛋白。,用0.3mol/L NaCl-0.02mol/L pH6.5磷酸缓冲液洗脱，收集第二峰。,将经DE-32纯化的鸡卵类粘蛋白溶液装入透析袋内，用蒸馏水透析，直到用1%硝酸银检查无氯离子为止。,调pH至4.0,加3倍体积的预冷丙酮，冰浴静置4小时以上，离心取沉淀，即得鸡卵类粘蛋白纯品。,标准胰蛋白酶比活性的测定CHOM粗品/纯品抑制比活性的测定,CHOM纯品的要求：品质：比活力8,000 BAEE unit/mg protein数量：200mg,亲和

19、吸附剂的合成,载体Sepharose 4B的活化,称取12克（湿重）Sepharose 4B 凝胶，用100ml 0.5mol/NaCl溶液淋洗，再用蒸馏水洗去NaCl，抽干。,加10ml 2mol/L NaOH,5ml环氧氯丙烷，5ml乙晴。室温下搅拌活化16-20小时。,用蒸馏水洗去未反应得残留试剂，再用0.1mol/L pH9.5 NaCO3缓冲液洗涤,处理好待用。,一步都不能出错！不要忘记测定和计算！,活化载体与鸡卵类粘蛋白（配体）的偶联,用10毫升0.1mol/L pH9.5 NaCO3缓冲液溶解鸡卵类粘蛋白，加入到活化好得Sepharose 4B凝胶中，室温下，搅拌20-24小时。

20、,偶联终止后，抽滤。用0.5mol/NaCl溶液洗去未被偶联的鸡卵类粘蛋白，再用蒸馏水洗去NaCl。,用0.1mol/L甲酸-0.5mol/LKCl,pH2.5的溶液洗，破坏残存的环氧基。再用蒸馏水洗至中性。,用30毫升亲和柱平衡液浸泡10分钟，脱气装柱。,一步都不能出错！不要忘记测定和计算！,猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶原的激活,取胰脏50克，加150毫升预冷的乙酸酸化水，用组织捣碎机捣碎。,匀浆。在5-10提取4小时以上。四层纱布过滤。滤液用2.5mol/L H2SO4调。静置2-4小时，过滤收集滤液就是胰蛋白酶粗提液。,酶原粗提液用NaOH调节pH8.0,加入固体CaCl2使溶液的Ca+浓

21、度达到0.1mol。加2mg结晶猪胰蛋白酶，搅匀，于4冰箱中激活12-16小时。待酶比活力达到800-1000BAEE/mg停止激活，用2.5mol/L H2SO4调，滤去CaSO4沉淀物，备用。,不要忘记测定和计算！,亲和吸附剂装柱上样洗脱,亲和层析纯化胰蛋白酶,不要忘记测定和计算！,价格表,品名 价格Sepharose 4B 4100元/1LDEAE-32 cellulose 2600元/100gSephadex G-25 1800元/100gAcetone,时间安排,讲授实验原理及操作 清洗用具、配制试剂（注意贴好标签）提取CHOM(做到丙酮沉淀CHOM，过夜）溶胀Sephadex G-

22、25（干粉）Sephadex G-25洗涤装柱（已溶胀）处理DEAE-32纤维素并装柱 测定标准胰蛋白酶活性,第一天,理顺思路！要做什么？怎么做？,第二天,离心收集CHOM Sephadex G-25装柱（溶胀24小时后）用Sephadex G-25脱盐提取第二份和第三份CHOM DEAE-32离子交换层析纯化CHOM透析测定CHOM的抑制活力（要求：数量：200mg 比活力 8,000BAEE/mg）,上课时间不得随意离开实验室！,提取和激活胰蛋白酶原 处理并活化Sepharose 4B 继续第二天的工作,第三天,值日生负责当天实验室的卫生和安全,CHOM与Sepharose 4B偶联 提取

23、和激活胰蛋白酶原（第二份）整理实验数据，准备ppt 继续第二天和第三天的工作,第四天,做好实验的同时，承担的公务不要忘记！,测定胰蛋白酶粗提液活性亲和层析纯化胰蛋白酶测定亲和层析纯化后的胰蛋白酶比活性继续第三天和第四天的工作继续整理实验数据，完成ppt制作,第五天,态度决定一切！注意实验细节！,完成所有的工作打扫实验室,第六天上午,结果展示,鸡卵粘蛋白产率（平均值):232.6 mg/100ml鸡蛋清偶联率：10mg/ml Sepharose 4B抑制率：94.6%亲和吸附率：1.48mg/ml Sepharose 4B(?)纯化倍数：14700.5/1022.9=14.37,实验课表现50分,出勤：12分操作：18分结果：4分总结：4分协作：4分公务：3分卫生：5分,标题（中英文对照）摘要和关键词（中英文对照）文献综述研究目的材料与方法结果与分析讨论参考文献致谢,课程论文,英文写作加2分,学位论文形式,A4规格打印稿,后记,实验报告每人一份，独立完成！,坚决打击盗版！如发现盗版，正版和盗版同样对待！,