生物化学及分子生物学(人卫第九版)-12DNA合成.ppt

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1、,作者:齐炜炜 高国全,单位:中山大学中山医学院,第十二章,DNA合成,第一节 DNA复制的基本规律,第二节 DNA复制的酶学和拓扑学,第三节 原核生物DNA复制过程,第四节 真核生物DNA复制过程,第五节 逆转录,重点难点,掌握DNA复制体系的组成、半保留复制的特点及其意义；掌握DNA复制的基本规律，DNA聚合酶的类型及功能特点,DNA复制的过程，原核DNA复制与真核DNA复制的主要区别；真核生物DNA端粒及端粒酶,非染色体DNA复制的其他形式；了解逆转录的发现发展了中心法则,DNA复制的基本规律The basic law of DNA replication,第一节,DNA复制的主要特征:

2、,半保留复制(semi-conservative replication)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinuous replication),在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链,一、DNA以半保留方式进行复制,半保留复制的概念:,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验:,含15N-DNA的细菌,第一代,第二代,依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致遗传的保守性

3、，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的,半保留复制的意义:,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGAC,GGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,AGGTACTG,TCCATGAC,AGGTACTG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,二、DNA复制从起始点双向进行,原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制,A.环状双链DNA及复制起始点B.复

4、制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),ori,ter,A B C,真核生物每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特征。每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域称为复制子（replicon）。复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位,三、DNA复制以半不连续方式进行,领头链(leading strand),后随链(lagging strand),沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的，这股链称为前导链（leading strand）另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续

5、延长，只能随着模板链的解开，逐段地从53生成引物并复制子链。模板被打开一段，起始合成一段子链；再打开一段，再起始合成另一段子链，这一不连续复制的链称为后随链（lagging strand）沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段（Okazaki fragment）,四、DNA复制具有高保真性,“半保留复制”确保亲代和子代DNA分子之间信息传递的绝对保真性高保真度DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复制保真性的机制之一；体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性；DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以及复制后修复系统对错配加以纠正,DNA复制的酶学和拓扑学Enzymology an

6、d topology of DNA replication,第二节,参与DNA复制的物质:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol活性：1.53的聚合活性 2.

7、核酸外切酶活性,核酸外切酶活性:,?,35外切酶活性:能辨认错配的碱基对，并将其水解53外切酶活性:能切除突变的 DNA片段,（一）原核生物有3种DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,原核生物的DNA聚合酶,个核心酶1个-复合物（、6种亚基）1对-亚基（可滑动的DNA夹子）,全酶结构包括：,DNA聚合酶全酶结构:,亚基（130 000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性亚基可能起组装作用,核心酶由、和亚基组成：,两侧的亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用,2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复

8、制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链,功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用,-复合物由6种亚基组成：、,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补,功能：,DNA-pol（109kD）:,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶,DNA-pol（120kD）:,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活DNA-pol 对模板的特异性不高，即使

9、在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复,（一）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,DNA-pol 起始引发，有引物酶活性DNA-pol 参与低保真度的复制 DNA-pol 在线粒体DNA复制中起催化作用DNA-pol 合成后随链DNA-pol 合成前导链,真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较,真核生物的DNA聚合酶,二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制:遵守严格的碱基配对规律聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能复制出错时有即时校对功能,（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择,利用“错配”实验发现，DNA pol

10、 对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能 DNA pol 对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实现其选择功能,（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性,DNA pol 的校读功能,三、复制中DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白质,（一）

11、多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,解链过程中正超螺旋的形成,复制过程正超螺旋的形成：,拓扑异构酶作用特点:既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶分类及作用机制：拓扑异构酶：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当 时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP 拓扑异构酶：切断DNA分子两股链，

12、断端通过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态,拓扑酶的作用方式：,四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：,DNA连接酶的作用：,功能:DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用也是基因工程的重要工具酶之一,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,原核生物DNA复制过程DNA replication in prokaryotes,第三

13、节,起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端,一、复制的起始,原核生物的复制起始部位及解链,（此图有误需修改）（此图错误部分包括文字和少了一个9bp重复序列已在图中标注，请编辑帮忙修改）,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,（二）引物合成和起始复合物形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为起始复合物,起始复合物和复制叉的生成,3,5,3,5,引物是由

14、引物酶催化合成的短链RNA分子,引物,引物酶,二、DNA链的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成,OH 3,3,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长,后随链的合成,在复制叉同时合成前导链和后随链,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合,三、复制的终止,子链中的RNA引物被取代,真核生物DNA复制过程Eukaryotic DNA replication process,第四节,真核生物与原核生物DNA复制的差异：真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进

15、速度慢等DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）、pol 和pol 参与。还需解螺旋酶活性、拓扑酶和复制因子(replication factor,RF),一、真核生物复制的起始与原核基本相

16、似,酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）：,酵母染色体含有多个复制起点。,元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白质复合物复制起点识别复合物(ORC)3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同,酵母复制起始点,真核DNA复制叉主要蛋白质的功能,现在认为pol 主要催化合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol 和DNA pol 所替换，这一过程称为聚合酶转换。DNA pol 负责合成后随链，DNA pol 负责合成前导链。,二、真核生物复制的延长发生DN

17、A聚合酶转换,前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶转换的原因是Pol 不具备持续合成能力DNA聚合酶转换的关键蛋白是RFC,DNA聚合酶/转换,真核DNA聚合酶转换和后随链合成,3,5,5,3,前导链,3,5,3,5,亲代DNA,后随链,引物,核小体,三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体,染色体DNA呈线状，复制在末端停止复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙,四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题,切除引物的两种机制,线性DNA复制一次端粒缩短,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,

18、3,5,5,端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成人的端粒重复序列为5-(TnGn)x-3这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比5端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题,组成：端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),端粒酶(telomerase),端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成端

19、粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3端。这些新合成的DNA为单链,端粒酶催化作用的爬行和端粒的延长过程,真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次,五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次,前复制复合物在G1期形成而在S期被激活,真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活,复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列,ORC至少募集两种解旋酶加载蛋白Cdc6和Cdt1,复制起点识别复合物（originrecognition complex

20、，ORC）识别并结合复制基因,三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2-7,前复制复合物（pre-RC）的形成,pre-RC的激活和组装真核DNA复制叉,激活pre-RC，以起始DNA复制抑制形成新的pre-RC,CDK控制pre-RC的形成和激活,真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格控制pre-RC的形成和激活,Cdk功能：,D-环复制（D-loop replication）是线粒体DNA的复制形式,六、真核生物线粒体DNA按D环方式复制,逆转录reverse transcription,第五节,逆转录酶(reverse tr

21、anscriptase),逆转录(reverse transcription),逆转录酶,一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制,RNA,DNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因,逆转录酶催化的cDNA合成,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重

22、要方法之一，此法称为cDNA法,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论,二、逆转录的发现发展了中心法则,1、DNA复制的基本特点2、原核生物的复制过程包括起始、延长和终止（1）起始是将DNA双链解开形成复制叉（2）复制的延长由引物或延长中的子链提供3-OH，供dNTP掺入生成磷酸二酯键，延长中的子链有前导链和后随链之分，复制

23、产生的不连续片段称为冈崎片段（3）复制的终止需要去除RNA引物、填补留下的空隙并连接片段之间的缺口使成为连续的子链,3、真核生物复制发生于细胞周期的S期，其过程与原核生物相似，但更为复杂和精致。复制的延长和核小体组蛋白的分离和重新组装有关。复制的终止需要端粒酶延伸端粒DNA4、非染色体基因组采用特殊的方式进行复制,本章知识点框架图：,DNA复制,原核生物复制,真核生物复制,起始：DNA的解链；引物合成和引发体形成延长：复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成 终止：双向复制的复制片段在终止点处汇合,起始：与原核生物基本相似延长：DNA聚合酶转换；核小体组蛋白的分离和重新组装终止：需要端粒酶延伸端粒DNA,