现代色谱分析HPL.ppt

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1、高效液相色谱法,高效液相色谱法的特点,高效液相色谱法与经典液相色谱法原理相同，无本质区别。1.新型高效输液泵，使分析时间缩短2.高效固定相，分离效能高，选择性好3.高灵敏度检测器,高效液相色谱法的应用范围,1.高沸点、热不稳定、分子量大、不同极性的有机物；2.生物活性物质、天然产物；3.合成与天然高分子涉及石油化工、食品、药品、生物化工、环境等领域。80的化合物可用HPLC分析。,HPLC的局限性,1.溶剂消耗大，成本高于GC,梯度洗脱的操作也比GC的程序升温复杂。2.缺少通用型检测器。近年来ELSD应用日益增多，有望成为通用型检测器，但稳定性尚需提高。3.HPLC不能代替GC，对于柱效要求高

2、的分析，仍需GC，如石油产品。4.HPLC 不能代替中、低压色谱，如受压易分解变性的具有生物活性的生化样品。,高效液相色谱仪,高效液相色谱,进样口,检测器,色谱图,色谱柱,溶剂,泵,混合器,(HPLC),流动相及贮液瓶,1.贮液瓶应耐腐蚀，用玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料。2.溶剂使用前必须经过0.45m滤膜过滤，过滤用液相色谱专用滤膜或4号微孔玻璃漏斗。,流动相的脱气,1.氦脱气法2.加热回流3.抽真空4.超声脱气5.在线脱气,HP1100 on-line degasser,高压输液泵,要求：1.泵体材料耐腐蚀。优质耐酸不锈钢，聚醚醚酮（PEEK)2.耐高压。4050MPa3.输出流量范围宽

3、。填充柱:0.110 ml/min(分析型），1100ml/min;微径柱：101000l/min4.输出流量稳定，重现性好。,恒流泵注射螺杆泵,注射螺杆泵的优缺点,优点：流量稳定，无脉动缺点：（1）液缸体积有限，约100150ml,不利于连续工作。（2）不能用于梯度洗脱。,恒流泵往复泵,单元泵工作原理,Authoring Division Name File NameSecurity Notice(if required),Damper,Purge valve,Seal,Piston,Ball Screw Drive,Motor with Encoder,Gear,Outlet Ball V

4、alve,Active Inlet Valve,往复泵的优缺点,1.可在高压下连续输液2.液缸容积小（几十几百微升），适合于梯度洗脱3.存在脉动4.柱塞与流动相直接接触，易造成污染,恒压泵,又称气动放大泵,过滤器,脉动阻尼器,梯度洗脱低压梯度,四元泵工作原理,Authoring Division Name File NameSecurity Notice(if required),Vacuum Chamber,MCGV,AIV,OBV,Damper,Purge Valve,Waste,to injection device,from solventbottles,MCGV 比例阀AIV 主动阀

5、OBV 单向阀,梯度洗脱高压梯度,梯度曲线,进样装置停流进样,From Pump,To Waste,手动进样器六通阀,进样装置六通阀进样,进样装置自动进样器,Agilent 1100 系列自动进样器,Precision,10 25 50 100,色谱柱,1.柱材料 内壁抛光、钝化的不锈钢管2.规格 a.内径4.6或3.9mm，柱长1030cm,510m填料,柱效500010000/m b.内径4.6或3.9mm，柱长510cm,35 m填料 c.内径0.52mm微填充柱 d.内径3050 m的毛细管柱,湿法装柱,紫外检测器固定波长检测器,紫外检测器可变波长检测器,紫外检测器光二极管阵列检测器,

6、DAD三维色谱图,折光指数检测器,电导检测器,荧光检测器,蒸发激光散射检测器,电化学检测器,利用氧化还原反应的检测器,氧化、还原反应,库仑阵列检测器,高效液相色谱的一种检测器属于电化学一类由数个多孔石墨电极串连组成在一次试验中，可同时提供多个氧化还原反应电势,库 仑 阵 列 电 池 示 意 图,Channel 1,Channel 2,Channel 3,Channel 4,Counter,Reference,Frit,Outlet,Inlet,Chromatographic and Voltammetric Resolution,12.0,12.5,13.0,13.5,14.0,14.5,15

7、.0,0.00,0.50,1.00,1.50,2.00,Retention time(minutes),Response(A),CHLOROGENIC ACID,CATECHIN,4HPAC,VANILLIC ACID,CAFFEIC ACID,SYRINGIC ACID,色谱工作站,ChemStation(Agilent 1100)Empower(Waters)CLASS VP(Shimadzu)杭州英谱N-2000千谱ZD1（本研究所研制）,固定相,内容：固定相载体结构正相色谱固定相键合相色谱固定相,Particles of Column,Packings,50 m,Large Porou

8、s,Particles,30 m,Pellicular,Beads,3-10 m,Microparticulates,2 m Active Surface,正相 HPLC,极性固定相,有机流动相,传统,目前,硅胶,氧化铝,氰基,二醇基,氨基,吸附色谱,键合相,适用于:,同分异构体的分离.,在有机/水流动相中不溶化合物的分离.,适用于中等极性化合物分离.,各种类型硅胶,a.薄壳玻珠 b.无定性全多孔硅胶 c.球形全多孔硅胶 d.堆积硅珠,吸附色谱保留机理,O,Si,O,Si,O,Si,O,O,H,H,O,R,O,H,H,O,R,机理,H-键,固定相,硅胶,氧化铝,流动相,有机溶剂,偶极矩,吸附色

9、谱中的保留,small k,large k,saturated hydrocarbons,olefins,aromatic hydrocarbons,organic halides,sulfides,ethers,nitro-compounds,esters,aldehydes,ketones,alcohols,amines,sulfones,amides,carboxylic acids,非极性,sulfoxides,极性,被强烈,吸附,硅胶柱和氧化铝柱的缺点,容易拖尾,样品被催化分解,不易梯度洗脱,含水量要控制,键合固定相,为了解决固定液的流失问题，将固定液通过化学反应共价键合到硅胶（载体

10、）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相。键合固定相对各种溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性，柱效高，使用寿命长，重现性好，可用于梯度洗脱。键合固定相已取代传统的液液分配色谱，成为HPLC中主要的固定相。,键合固定相,键合固定相的“刷子”结构,键合相柱优点,固定相不易被流动相洗脱,使用极性范围宽,键合固定相的类型,SiOC型SiC型或SiN型SiOSiC型,SiOC型,SiOH ROH SiOR H2O此类固定相柱效高，易水解、醇解，热稳定性差，只能用弱极性流动相用于分离极性化合物。,SiC型或SiN型,SiOH SO2Cl2 SiCl（氯化硅胶）SiCl RMgBr SiR（R=苯基或烷基）S

11、iCl NH2CH2CH2NH2 SiNHCH2CH2NH2,SiOSiC型,X 代表Cl、OH、OCH3、OC2H5等，R 代表C8H17、C10H21、C18H37、(CH2)nCN、(CH2)nNH2、CH2OH、CHOHCH2OH等此类固定相是目前最常用的键合固定相。,键合官能团含量,1.表面覆盖量（硅胶表面含碳量）250(一般约为10）2.表面覆盖率（单位表面上键合的有机官能团的量与可反应的硅羟基的量之比）,影响溶质保留行为的因素,1.表面覆盖率越大，保留越强2.硅胶表面残留硅羟基产生吸附作用，引起谱峰的拖尾和不对称。3.氢键力顺序：胺基氰基芳硝基二醇基醚基4.胺基柱具强极性，在酸性

12、水溶液中作为弱阴离子交换剂，用于分离酚、羧酸、核苷酸；作为反相固定相可用于单糖、双糖、多糖的分离。不能用于分离羰基化合物。,5.氰基柱为质子受体，中等极性，分离选择性与硅胶类似，对酸性、碱性样品可获得对称的色谱峰。6.芳硝基柱呈弱极性，对芳香族化合物和多环芳烃有良好的分离能力。7.二醇基键合相呈弱极性，可用于分离有机酸及其齐聚物，还可作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱固定相。8.醚基键合相也呈弱极性，可分离能形成氢键的化合物，如酚类、硝基化合物，也可作为凝胶过滤色谱固定相。,使用键合固定相应注意的问题,1.稳定性a.表面覆盖率越高越稳定b.反相键合相稳定性高于正相键合相c.与流动相pH有关，通常应保

13、持在28之间2.重现性不同厂家，不同批号产品分离特性不同,使用键合固定相应注意的问题,3.选择性同一种键合固定相，用两种极性参数相近的流动相时，分离结果会相差很大。如在ODS柱上分离山梨酸和苯甲酸，40甲醇水溶液作流动相时无法分离，而用32.5%四氢呋喃水溶液能完全分离。,使用键合固定相应注意的问题,4.再生a.对正相柱，可用1:1甲醇氯仿冲洗b.对反相柱，用甲醇再生，若效果不好，可用丙酮、二甲基甲酰胺或0.01mol/L无机酸进行再生。,色谱柱保护,过滤所有的溶剂和样品使用保护柱仪器在使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液柱子在不使用时，两端密封保存在适当的溶剂中保存柱子注意色谱柱的pH

14、值使用范围不要高压冲洗柱子不要高温下过长时间使用硅胶键合相,操作条件流动相对色谱柱寿命的影响,普通键合,StableBond稳定键合,低 pH(1-3)-由于酸催化水解导致键合相的流失,*,H3O+,*易水解的硅氧键,操作条件流动相对色谱柱寿命的影响,键合相水解速度随温度的升高而加大,StableBond CN(二异丙基苯基 CN),普通键合 CN(二甲基丙基CN),低pH 的淋洗液 高温(60C),操作条件流动相对色谱柱寿命的影响,普通键合,Eclipse XDB(Extra Densely Bonded超高密度键合),高 pH(7-14)-硅胶溶解,pH 升高温度升高磷酸盐 硼酸盐 有机溶

15、剂,色谱柱的良好使用规范,使用新鲜的水溶液,要注意使用生物稳定剂,如叠氮化钠,储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如乙腈,避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头,运输中变干了的色谱柱要完全浸湿,如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理,定期用强极性溶剂冲洗色谱柱,清楚了解色谱柱填料适用的:,了解样品溶剂对溶解度及分离的影响,pH范围，温度，化学适应性,溶剂使用前必须过滤,预柱和保护柱,由泵输送的流动相,预柱,进样器,保护柱,分析柱,至检测器,预柱净化流动相HP Part No.:79916KT-102,保护柱净化样品,截留或浓缩柱,Authorin

16、g Division Name File NameSecurity Notice(if required),H,卡套柱：带可重复使用的末端接头和一体化的保护柱柱芯,无保护卡套柱芯,有保护卡套柱芯,带Techtron 卡套柱芯的Zorbax 保护柱,min,5,10,15,20,25,30,35,mAU,140,142.5,145,147.5,150,152.5,155,157.5,160,min,5,10,15,20,25,30,35,mAU,140,142.5,145,147.5,150,152.5,155,157.5,160,BDS ODS Hypersil 250-2 mm with i

17、ntegrated Guard Column,BDS ODS Hypersil 250-2 mm without Guard Column,2 mm 内径卡套柱有和无保护柱的比较,在色谱柱安装前、后测试压力差如果柱两端的反压很高，反接色谱柱，再用10-20倍柱体积的流动相冲洗柱体后，再测试压力差如果出现沉淀，(如：蛋白质凝聚，细胞物，聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如0.1%TFA/80%乙腈,6M 盐酸胍,THF等清洗以除去堵塞物若仍无效，应考虑更换过滤片,色谱柱的修复和再生-物理性阻塞,柱进样口滤片,密封垫圈,柱体,Female End Fitting,Male End Fitting,操

18、作注意事项：带手套填料不能变干不要接触色谱柱体 加热填料会被挤出不要拧得过紧,色谱柱故障诊断更换进样口滤芯,由于键合相水解或硅胶溶解而造成的色谱柱填料变化是不可逆的 由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的洗清使之修复 梯度洗脱的方式(水-强有机溶剂)通常最有效 低 pH 流动相,如 0.1%TFA 或 0.01M H3PO4,也是有效的 适当升高温度也有帮助(60-80C),色谱柱的修复和再生-化学变化-I,某些溶液，如6M盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素可用于清除蛋白质的沉积某些填料(XDB,有机聚合物)，可使用高pH 水/有机溶液，如：0.01M NaOH溶于50%异丙醇/水溶液。硅胶基质应尽量

19、减少接触时间(15-30 min)。,色谱柱的修复和再生-化学变化-II,例子：4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18流速:1 mL/min;温度:80CA:0.1%TFA 水溶液 B:0.1%TFA 乙腈溶液100%A for 30 min.;0-100%B over 30 min.;Hold 100%B for 30 min.,Return to 100%A in 5 min.重复3次,如果事先适当注意，大部分液相色谱柱的问题是可以预防的-流动相必须是互溶、无颗粒的-使用保护柱和在线过滤器，并定期更换-采用恰当的样品制备过程-采取恰当的色谱柱清洗步骤-不同的操

20、作条件选用不同的色谱柱(e.g.SB:pH 1-6,XDB:pH 3-11，Extend:2-12)-保存柱反压和其他重要色谱参数的记录，即(e.g.R,N,As,k)-色谱柱保存时必须充满有机溶剂，如乙腈,流动相,要求参数正相色谱流动相选择反相色谱流动相选择,流动相的要求,与固定相不互溶与检测器相匹配对样品有足够的溶解能力粘度小，沸点低纯度高毒性低,液固吸附色谱流动相,1.溶剂强度参数。根据Snyder的定义，。为该溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附能。越大，表示该溶剂洗脱能力越强。,一些纯溶剂的。值己烷 0.00 乙酸乙酯 0.38异辛烷 0.01 二噁烷 0.49四氯化碳 0.11 乙腈

21、0.50氯仿 0.26 异丙醇 0.63二氯甲烷 0.32 甲醇 0.73四氢呋喃 0.35 水 20.73乙醚 0.38 乙酸 20.73_,液固吸附色谱流动相,2.极性参数P P是溶剂与乙醇、二氧六环、硝基甲烷等极性溶质作用的综合量度。混合溶剂的P：PViPi3.溶剂的选择性参数Xe、Xd、Xn 分别表示溶剂接受质子、给予质子和偶极作用的能力。,常用溶剂的极性参数和选择性参数,Snyder溶剂分组三角形,Snyder溶剂分组三角形,正相色谱流动相的选择,由于固定相是极性的，P值增大，洗脱能力增加，样品k值降低。分离时，首先选择合适P值的溶剂，使样品k值在110。常用溶剂是在烷烃中加入一种极性较大的溶剂为极性调节剂，如在正己烷中加入氯仿。确定极性参数P后，若分离不好，则改用其它组别的强溶剂。,反相色谱流动相的选择,由于固定相是非极性的，P值增大，洗脱能力降低，样品k值增大。反相色谱一般以水作为基础溶剂，再加入一定量与水互溶的有机调节剂，常用的有甲醇、乙腈、四氢呋喃等。为了适应不同溶质的需求，有时需加酸碱或缓冲溶液。常用的酸为乙酸、磷酸，碱用胺类，缓冲溶液常用磷酸盐或醋酸盐缓冲液。,