样品前处理及制备技术.ppt
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1、样品前处理及制备技术,丁卓平 教授,目录,一、概述,第一章 溶剂萃取(2学时,自学1学时),第二章 蒸馏,第三章 固相萃取,第四章 气体萃取(顶空技术Headspace),目录,第五章 膜分离,第六章 热解吸,第七章 衍生化技术,一、概述,指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。,是消除基质干扰、保护仪器、提高检测方法的灵敏度、选择性、准确度、精密度。,1,2,3,5,4,基体复杂有水分、糖类、脂肪、蛋白质等固态有水果、蔬菜、肉、鱼、蛋、家禽、调味品等碳水化合物食品。液态有饮料、乳制品等。,检测限量越来越严格如欧盟要求食品中氯霉素检测限量要求为O.1g/kg,己烯雌酚要求为
2、0.05g/kg。,各目标化合物的性质差异极大如极性、沸点、热稳定性等,多组分并存对人类健康影响有协同效应 例如狄氏剂、DDT等农药与多氯联苯共存时,会使毒性增加一倍,浓度极低1防止样品基体组分的信号掩蔽痕量被测物和污染仪器2接近仪器的检测限,3、食品样品前处理方法的选择取决于食品危害残留物质分析的特点,4、举例,9 氯霉素类(Chloramphenicols)P129-13210 大环内酯类(Macrolides)和林可霉素类(Lincosamides)P143-150,举例:HPLC测定邻苯二甲酸酯的样品处理:,净化,LLE(BBP、DBP),1mL甲醇溶解,2g样品,2mL甲醇,4mL正
3、己烷:甲基叔丁基醚(v:v,1:1),震荡提取2次,离心,上清氮吹,正己烷定容至4mL。,冷冻去脂,上清液定容至4mL。,SPE(DEHP、DNOP、DINP、DIDP),氮吹浓缩,本底的去除、活化、上样、淋洗、洗脱,牛奶和乳酪,奶粉,黄油,2g样品,水浴融化,用5mL甲醇提取2次,离心,上清氮吹,正己烷定容至4mL。,5.分析包括,分析方法的选择,分析的全过程,样品的采集、制备及保存,样品前处理,本课程的内容,样品的采集、制备及保存,一、样品的采集分析的首项工作从大量的分析对象(即总体中)抽出一部分(即样品)作为分析材料,这项工作称为样品的采集。说明:样品来自总体,并代表总体,和总体有相同的
4、属性,样品的采集、制备及保存,(一)采样原则1.采集的样品要均匀,有代表性,能反映全部被检食品的组成;2.采样过程中要设法保持原有的理化指标,防止成分逸散或带入杂质。重要性说明:否则,即使以后的样品处理、检测等都非常精密准确,其检测的结果亦毫无价值,以致导致错误的结论。,样品的采集、制备及保存,(二)采样步骤1.检样:由分析对象大批物料的各个部分采集的少量物料成为检样。2.原始样品:许多份检样综合在一起成为原始样品。3.平均样品:原始样品经过技术处理,再抽取其中的一部分供分析检验的样品,样品的采集、制备及保存,二、样品制备:粉碎、混匀、缩分 按采样规程采取的样品往往数量很多,颗粒太大,组成不均
5、匀。因此为了确保分析结果的正确性,必须对样品进行粉碎、混匀、缩分,使任何一个部分都能代表全部样品的成分。,样品的采集、制备及保存,三、样品保存样品易变:1.食品是动植物组织,是活细胞,有酶的活动,又因食品中的营养素是天然培养基;2.经过采样,破坏了一部分组织,使汁液外流。,样品的采集、制备及保存,保存原则 1.应防止污染 2.应防止腐败变质 3.应稳定水分 4.应固定待测成分(不稳定,易挥发)。(应结合分析方法,在采样时加入某些溶剂或试剂,使待测成分处于稳定状态),样品的采集、制备及保存,保存方法净:器具干净防止污染和变质密:稳定水分防止挥发损失避免引入污物冷:冷藏(05)下运输和保存 降低化
6、学反应速度快:尽快分析避光:VB1、胡萝卜素、黄曲霉素B1,易发生光解 冷冻干燥:不能马上分析的样品最好冷冻升华 干燥来保存,5、本课程的目的,知道每一步所加药品或操作步骤的作用和目的,能看懂已确立的检测方法的前处理过程。,为研究建立新的检测方法、为改进前处理方法奠定基础,第一章 溶剂萃取(2学时,自学1学时),第一节、液-液萃取,第二节、液-固萃取,第三节、液-气萃取(溶液吸收),第四节、萃取溶剂的选择,第一章 溶剂萃取,什么叫作溶剂萃取 在液体、固体或者气体中含有的某些物质,使用溶剂将它们溶解出来,这样的方法也称作溶剂萃取。液体样品最常用的萃取技术之一是溶剂萃取,通常叫做液一液萃取。据调查
7、,在分析化学实验室中几乎半数的人员常常使用液一液萃取。溶剂萃取原理 液一液萃取、液一固萃取和液-气萃取(溶液吸收)等,它们都是属于两相间的传质过程,即物质从一相转入另一相的过程。,液一液,使用石油醚萃取水样品中的氯苯类化合物就是从液相到液相传质的液一液萃取,使用二硫化碳萃取活性炭中吸附的有机溶剂就是从固相到液相传质的液一固萃取;,液一固,举例,第一节 液-液萃取,液-液萃取是经典的提取方法之一,液-液萃取常用于样品中被测物质与基质的分离,在两种不相溶液体或相之间通过分配对样品进行分离而达到被测物质纯化和消除干扰物质的目的与其它方法相比,液-液萃取法仍是目前最常用的样品处理方法,其原因是:(1)
8、通过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来,减少杂质对测定的干扰;(2)操作简单快速、经济实用;(3)可将萃取液蒸发,使组分富集;(4)可一次进行同类组分的萃取。,液-液萃取原理,它基于被测组分在不相混溶的两种溶剂中溶解度或分配比的不同来达到分离、提取或纯化的目的Nernst分配定律:物质将分配在两种不混溶的液相中。如果以有机溶剂和水两相为例,将含有有机物质的水溶液用有机溶剂萃取时,有机化合物就在这两相间进行分配。在一定的温度下有机物在两种液相中的浓度比是一常数:KD=cocab 式中,KD是分配系数,co是有机相中物质的浓度,cab是水相中此物质的浓度。,液-液萃取分类,常规液-液萃取,
9、常规的液-液萃取方法使用分液漏斗,需要101000mL的液相(每一种)。对于一步萃取,为了获得较大的回收率(在某一相中达99以上),分配系数KD必须大于10,因为相比(VoVaq)必须保持在0.110之间。在大部分的分液漏斗的液液萃取方法中,定量回收需要两次或更多次的萃取。如下式:E=1一1(1+VoKDV)n(3-3)式中,n是萃取次数。如果某一种物质的分配系数KD=5,两相的体积相等时(V=1),必须进行3次萃取(n=3)才能获得大于99的回收率。每一次萃取都使用新鲜的溶剂。一般来说,多次萃取与一次萃取相比具有较高的萃取效率。,连续液-液萃取,如果KD值小或者需要的样品量大,多次萃取是不实
10、际的。并且萃取的总体积也太大。在某些情况下,萃取的动力学可能是很慢的,需要很长时间才能建立平衡。在这些情况下,可以使用连续液一液萃取技术。,连续液-液萃取,在连续液一液萃取中,新鲜的有机溶剂可以循环地连续使用,通过含有被萃取的水相。图3-1表明一个连续液一液萃取器的结构,使用比水重的有机溶剂进行萃取。这种萃取溶剂从烧瓶中被加热蒸馏,上升到冷凝器被冷凝,并淋漓出两种不混合的水和带有萃取物的溶剂。最后,溶剂和萃取物返回到烧瓶中。此过程连续地进行直到足够量的被测物质被萃取出来。在某些模块中,烧瓶也作为浓缩器使用,连续萃取之后便于蒸发和除去萃取溶剂。,连续液-液萃取,优点,无需人工操作,可以处理低KD
11、萃取,使用较少的溶剂,较高的效率。,缺点,在蒸馏过程中可能会损失高挥发性的化合物,热不稳定化合物也可能会降解,除非他们能够接受沸腾溶剂的温度。,逆流萃取,逆流萃取(Countercurrent Distribution)装置可以提供1000或者更多的塔板数用于更有效的液一液萃取,但是它需要很长时间和工作量。逆流萃取可以回收分配系数KD值相当小的组分。,微萃取,采用0.0010.01范围的相比率值(V)进行萃取过程。与传统的液一液萃取相比,它采用小体积有机溶剂。微萃取提供的回收率较差,但是在有机相中的欲测物质的浓缩大大地增高。此外,使用的溶剂量也大大地减少。在容量瓶中进行萃取,可以选择比水密度低
12、的有机溶剂,结果有机溶剂积累在瓶颈部分并且便于抽取它们。在有机相中的被测物质的浓缩可以通过盐析作用得到加强。可以采用样品加入内标和萃取校正标准的方法进行测定。,萃取小柱(Cartridges)技术,使用萃取小柱代替分液漏斗完成液一液萃取,将一种液相混合到一种惰性介质中并经过渗滤,与色谱相类似的方式,不相容相进入不流动相(固定相)。这些萃取小柱同固相萃取小柱一样,在聚乙烯管中填充经煅烧助溶的高纯硅藻土。这些管的体积从0.3300mL(有商品出售)。具有大表面的填充物可提高萃取效率、防止水溶液样品(被硅藻土吸附的)和有机萃取溶剂之间的乳化。此技术操作简单,可以用于含有误用药物的体液的萃取。可先使用
13、样品润湿萃取小柱中的吸附剂几分钟后,再将有机萃取溶剂加入到萃取小柱中。当有机溶剂还保存在萃取小柱中时(已经含有萃取物质),分别调节pH值在45和90时,以萃取样品中的酸性或碱性物质。,在线萃取,在线萃取优缺点,可用于非常小的样品体积(低于100mL),使用小量的试剂和有机溶剂(费用降低),闭环系统(样品不会暴露到大气中,防止了污染和对人的毒性及溶剂的可燃性),高的样品萃取产率,可充分自动化,流动系统的接口可直接与分析仪器相连接。,灵敏度较低,要求更复杂的硬件(泵、相沉淀器、相分离器)。,自动液一液萃取,传统的液一液萃取需要大量的手工操作,当样品负荷增加,并超过了合理的程度,人们就会考虑自动化。
14、许多仪器厂家研制了全部自动或者部分自动地完成样品萃取和浓缩的装置。美国OI分析公司根据EPA SW-846方法35103520,研制了ExCell自动液一液萃取系统。此系统使用二氯甲烷作为萃取剂,在约3h时间内可同时处理6个1 L水样品中半挥发性物质的液一液萃取。此系统的萃取过程与传统的分液漏斗的液一液萃取不同,如图33所示。,自动液一液萃取,在萃取池中装有二氯甲烷溶剂,溶剂液体表面上通过风机作用使萃取池形成轻微的真空,水样品以液滴方式连续地被引进到萃取溶剂中。水样品液滴在进入二氯甲烷溶剂过程中,先通过一个专用的由外部电极产生的电场区域。电场促使萃取溶剂中的水滴进行运动,液滴形状产生扭曲并分裂
15、成更小的液滴。这种分裂在水相和二氯甲烷相之间的界面上大量增加,导致水滴中的欲测定有机物分子快速地扩散进入二氯甲烷中。,二氯甲烷,真空,水滴运动,乳化现象的产生,液-液萃取中非常重要的操作是急速地振动样品。此步骤可确保两相的完全接触,有助于质量传递。在分液漏斗发生完全的混合,产生大量的界面区域使得有效的分配出现。由于物质剧烈的振动,在液一液萃取中乳化现象经常发生,特别是那些含有表面活性剂和脂肪的样品。收集欲测物质必须先进行破乳。为了防止乳化形成,应用采取加热或加盐的方法破乳。通过改变KD,改变溶剂或化学平衡作用的添加剂,诸如使用缓冲剂调节pH,盐调节离子强度等,乳化的害处,乳化现象能使被测组分损
16、失。,1,2,3,5,4,加盐,使用加热-冷却萃取容器,通过离心作用,加进少量的不同的有机溶剂,通过玻璃棉塞过滤乳化液样品;通过相过滤纸过滤乳化液样品;,破乳的常用方法,破乳的常用方法,为了防止乳化,可应用较大体积的有机溶剂,避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力而破乳,若已发生严重的乳化现象,可将试管置于冰箱中冷冻破乳。,如何避免玻璃容器壁对某些药物的吸附,1,萃取过程中所用的玻璃容器壁对某些药物的吸附是不可忽略的特别是当药物浓度较低时更是如此。对萃取所用的器具进行硅烷化处理,2,还常在萃取剂中加入异戊醇。异成醇能减少玻璃壁的吸附,还可减少萃取过程中乳化的形成。也可以加入二乙胺,二乙胺能
17、显著减少吸附作用,提高萃取回收率。,第一章 溶剂萃取(2学时,自学1学时),第一节、液-液萃取,第二节、液-固萃取,第三节、液-气萃取(溶液吸收),第四节、萃取溶剂的选择,第二节、液-固萃取,最简单的液-固萃取就是将欲萃取的固体放入萃取溶剂中,加以振荡,必要时也可加热,然后利用离心或过滤的方法使液、固分离,欲萃取组分进入溶剂。但是,这种最简单的液一固萃取只能用于十分容易萃取的组分,它的萃取效率很低,加热时溶剂也容易损失,一般很少使用。,第二节、液-固萃取,最常用的液一固萃取是索氏萃取,如图3-4(a)所示3。索氏萃取装置有商品产品,其规格有1 25,250,500mL的。也可以自行设计加工制造
18、。样品经索氏萃取之后,通常需要对萃取液进行浓缩和定容的程序。浓缩和定容的程序通过KD(Kudema-Danish)浓缩器完成。KD浓缩器的结构组成如图34(b)所示。最后可将样品萃取液浓缩定容到15mL。,第二节、液-固萃取,萃取时的温度,提高萃取时的温度虽然可以提高萃取效率,但是萃取温度也不能任意提高。当接近或超过溶剂的沸点时,溶剂汽化,致使萃取难以进行;如果萃取温度过高,常常是被萃取出来的杂质也随着增多。通常,萃取时的温度应当比所用的溶剂的沸点低1015。,第一章 溶剂萃取(2学时,自学1学时),第一节、液-液萃取,第二节、液-固萃取,第三节、液-气萃取(溶液吸收),第四节、萃取溶剂的选择
19、,三、液-气萃取(溶液吸收),溶液吸收装置由装有吸收液的气体吸收管、抽取气体样品的动力装置(或空气采样泵)和控制抽取气体流量的装置等基本部分组成,如图3-6所示。气体吸收管、空气采样泵等均有商品出售,可根据要求选取不同的规格和技术指标。,液-气萃取(溶液吸收)装置,液-气萃取(溶液吸收)原理,使用溶液吸收方法可以收集气态、蒸汽和气溶胶等样品,被抽取气体样品通过吸收液时,在气泡和吸收液的界面上,欲测组分的分子由于溶解作用或者化学反应很快地进入吸收液中,同时气泡中间的气体分子因存在浓度梯度和运动速度极快,能够迅速地扩散到气-液界面上。因此,整个气泡中欲测组分的分子很快地被溶解吸收。,综上所述,溶剂
20、萃取是分析实验室常常使用的色谱分析样品制备方法。大部分的方式是在分液漏斗中一步或者多步萃取。连续萃取方法和反相萃取使它容易处理具有低分配系数的物质的样品。微萃取提供了灵敏度的改进和减少了溶剂用量。但是,必须改进回收率。萃取夹(萃取小柱)模仿传统的液一液萃取并且使得样品收集变得容易当处理大体积样品时,在线萃取系统、自动工作站和自动进样器是有效的,而手动的液一液萃取容易引入较大的误差。固相萃取是一种与经典液二液萃取具有竞争的技术之一,特别是在常规实验室的应用中尤其这样。,第一章 溶剂萃取,第一节、液-液萃取,第二节、液-固萃取,第三节、液-气萃取(溶液吸收),第四节、萃取溶剂的选择,第四节、萃取溶
21、剂的选择,液-液萃取常用的有机溶剂有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。,溶剂选择应注意以下几点:,溶剂的极性:根据相似相溶原理,极性组分易溶于极性溶剂,反之亦然,应根据被测组份的极性选择相似极性的溶剂。例如,代谢物的极性一般比母体药物高,可选择极性较强的溶剂萃取,将其与母体药物分开。相反,若用较低极性的溶剂萃取,则可选择性地将母体药物同代谢物萃取分离开。又如生物材料中的内源成分大多为极性化合物,为了减少其混入萃取液中的少量杂质,则宜使用极性低的溶剂萃取。当然,实际萃取被测组分时,还常于萃取溶剂中加入第二种溶剂,以调整极性,使达到选择性萃取
22、;,溶剂选择应注意以下几点:,溶剂的沸点:萃取分离后的有机相通常需置温水浴中通压缩空气(或氮气)使挥发,将被测组份浓集,因此萃取溶剂的沸点就不应接近或高于水的沸点,否者挥发困难;,溶剂选择应注意以下几点:,溶剂的毒性:使用对人体有害的溶剂萃取时,应在通风橱内进行。在常用溶剂中,乙酸乙酯既安全又无毒,对不同极性的被测组分均有较高的萃取回收率,又易于挥干,萃取物中混入的内源杂质量少,是较理想的首选溶剂;,溶剂选择应注意以下几点:,溶剂与水的互溶性:有的溶剂如乙醚,萃取后可混入大约1.2%的水分,因此伴随带入一些水溶性杂质。乙醚萃取能力强,又易于挥干浓缩,为常用萃取溶剂,除去混入水分的方法是加入无水
23、Na2SO4脱水,减少混入的水溶性杂质量。无水Na2SO4使用前要烘干处理,溶剂选择应注意以下几点:,溶剂与水的互溶性:与水混溶的有机试剂,诸如低分子量的醇、酮、醛、甲基氰和二噁烷等,都不适合于液一液萃取。在液一液萃取中,分析学家应该选择在水中具有低溶解性(小于10)的有机溶剂和萃取后易挥发的、与分析技术匹配的、具有极性和氢键性质的有机溶剂。这样可以强化有机相中欲测定物质的回收率。,某些适合于液一液萃取的溶剂,某些溶剂与水的混溶性,溶剂极性的大小,溶剂极性的大小,可根据介电常数和偶极矩进行判断溶剂极性的大小还应该考虑分子间特殊作用力应该选择极性有机溶剂从水样品中萃取极性物质,有机相与水相容积比
24、的选择,萃取过程中加入的有机溶剂并非越多越好,而应适量。一般有机相与水相容积比以1:1或2:1为佳,据被测组份的性质及方法需要,有时也增加有机相的比例。另外,萃取时若往水相中加入少量比重大的有机溶剂(如氯仿),而该溶剂对药物的溶解度又比较大,则可将药物从水相中浓集于小体积的有机相中,若萃取时使用的是尖底试管,则富含药物的有机相沉集于管尖部位,可直接取样分析,或将其分离出来。萃取时于水相中加入有机相后,一般只萃取一次。特殊情况下(如杂质不易除去),则必须将第一次萃取分出的含药有机相,再用一定pH的水溶液反萃取,最后再从水相将药物萃回到有机相中。,离子对试剂,一些酸性或碱性较强的有机药物在体液中呈
25、离解状态,成为亲水性极强的带电荷离子,即使控制pH也不能抑制它们的电离,不能用有机溶剂将其自体液中提取出来。对于上述呈离解状态的药物,可加入离子对试剂,使它们形成具有一定脂溶性的离子对络合物,用有机溶剂将其从水相中萃取出来。,离子对试剂,阳离子药物配对的离子对试剂则为阴离子,其中以烷基磺酸类(RSO3H)为最常用,实际起配对作用的是其阴离子RSO3-,R为烷基,其碳链越长,生成的离子对络合物脂溶性越高。实际应用的试剂为其盐类,如戊烷磺酸钠(R=C5H11)、己烷磺酸钠(R=C5H11)和庚烷磺酸钠(R=C6H13)。此外,R除为直链烷烃外,也可选用芳烃基,如可用-萘磺酸作为离子对试剂。除上述烷
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