实验动物遗传质量控制.ppt

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1、实验动物遗传质量控制,1、实验动物的遗传背景是影响实验动物实验结果发生变异的主要因素2、同基因型动物：品系内所有个体的遗传背景相同或相近。不同基因型动物：品系内所有个体的遗传背景具有较大的差异。3、实验动物遗传学质量控制是实验动物标准化的主要内容之一。从遗传学角度讲，实验动物是具有明确遗传背景并受严格遗传控制的遗传限定动物。根据其遗传特点不同，实验动物分为近交系、封闭群（远交群）和杂交一代动物。,实验动物遗传控制基本概念,4、在动物分类学中，“种“（spcies)是动物分类的基本单位。而实验动物学品种(stock)、品系(strain)的概念超出了一般动物学分类的概念，把同一种动物中具有不同遗

2、传特性的动物分成不同的品种、品系，它们各自有其品种品系的特征。品种、品系才是实验动物分类的基本单位。,遗传限定的动物,相同基因类型,不同基因类型,近交系,封闭群,同源突变近交系,同源导入近交系,分离近交系,重组近交系,杂交F1代,远交种,突变种,品系,品种,5、实验动物品种品系应具备的四个基本条件：A:相似的外貌特征；B：独特的生物学特性；C：稳定的遗传性能；D：具有共同的遗传来源和一定的遗传结构。,交配制度是动物不同代之间以某种特定的交配方式相互发生联系，其预期的基因传递结果是通过遗传学和概率的知识来分析表达。交配型是不同基因型之间通过动物交配实现交流的方式。分为：近交（Incross）、杂

3、交（Cross）、间（Intercross）和回交（Backcross）,交配制度和交配型,近交（Inbreeding）：即近亲繁殖，是指血缘关系极为相近的个体之间或遗传组成极相似的个体之间进行的交配繁殖。杂交（crossing）：通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法。回交（back cross）：子一代和两个亲本的任一个进行杂交的方法叫做回交。在育种工作中，常利用回交的方法来加强杂种个体中某一亲本的性状表现。间交：自交或称互交（Intercrosses）：亲代为两个杂合子交配。,概念：近交系动物也叫纯系动物，是相同基因类型动物中最主要的一种。它是经连续20代

4、以上的全同胞兄妹或亲子交配培育而成，且品系内所有个体都可追溯到起源于20代或以后的一对共同祖先的遗传群体。从遗传上来说，近交系的培育是从群体多态杂合的遗传组成中，选择保留一小部分，淘汰其它大部分的一个过程。经过20代近交后，近交系的个体有98.6%的遗传位点是纯合的，因此个体间的遗传差异很小。然而，不同近交系之间由于近交而固定的基因不同，遗传差异很大。,近交系 Inbred strain,通常禽类和兔类等实验动物的血缘系数达到80以上时(相当于亲兄妹交配4代)，即可称为近交系,近交系数（Coefficient of Inbreeding,F):即动物个体的基因组成中，纯合子基因的出现率。又可称

5、为后代个体基因位点固定同一祖先基因的比率。血缘系数（Coefficient of Relationship，R）：是两个个体间的遗传学相似性。,优点：纯合性；同源性；均一性；长期的遗传稳定性；可分辩性；个体性；分布的广泛性；背景资料和数据较为完整缺点：近交系的主要缺点在于近交形成的近交衰退现象，表现在其生活力和生育力降低，对外界环境的变化较为敏感，抗病和适应环境等能力减退。这就增加了近交系动物饲养繁殖的难度。,近交系动物的命名,一般以大写英文字母命名，亦可以用大写英文字母加阿拉伯数字命名，符号应尽量简短。如A系，TA1系等。例如：C3h C3H C3HBalb/c,129,A,C57BL/6,

6、近交系动物的特性,1、基因纯合性 在一个近交系内所有动物的所有基因位点都是纯合子、个体之间、祖代个体与后代个体之间都是纯合子。这样的个体与品系内任何一个动物交配所产生的后代，也应是纯合子。因此，同一近交系动物的基因是一致的，没有暗藏的隐性基因。2、同基因性 同一个近交品系中所有个体在遗传上是同源的，个体间极为相似，具有基本相同的遗传组成和遗传特点，也就是基因型相同。因此，同品系个体间可进行组织或肿瘤移植，也可用一只动物检测该品系的基因型。,3、表现型的均一性 同一近交系动物，在相同环境因素的作用下，由于同基因性，其表现型是均一的，如血型、组织型、体重、毛色、可遗传疾病的发病率、对药物的反应、甚

7、至行为的类型等。因此,使用较少量的近交系动物可达到生物统计需要的精密度。4、长期的遗传稳定性 近交系动物的基因高度纯合，坚持近亲交配则增加其在特定部位纯合子，减少了遗传变异，使动物的基因型可长期处于稳定状态，导致近交系动物长期遗传稳定性。近交系动物的遗传变异仅发生在少量残留杂合基因，或基因的突变，而这种机率非常低。,近交系动物的特性,5、个体性 每个品系在遗传上都是独特的，有些品系可能发生一些疾病，成为研究人类疾病理想的模型。品系间的差别显示在量上，而不是在质上，在研究上非常有用：可在众多的近交系中，筛选出对某些因子敏感，和不敏感的品系，以达到不同的研究目的。,近交系动物的特性,6、分布广泛性

8、 近交系动物个体具备品系的全能性，任何个体均可携带该品系全部基因库，引种仅需1-2对动物。不少近交系动物已分布在世界各地，意味着：不同地区，不同国家的科学家有可能重复或验证已取得的理论和数据。,近交系动物的特性,7、背景资料和数据完整性 近交系动物在培育和保种过程中都有详细记录，一些常用品系具有相当数量的背景资料；有大量文献记载了各种品系的生物学特性。这些有关品系的特征、寿命和自发性疾病等资料，对今后的研究工作的设计和动物实验结果的解释提供便利条件。8、可分辨性 每个近交系都有自己独特的生化标志基因。研究者在掌握了遗传质量监测方法后，通过建立品系的遗传概貌，和定期的遗传检测，可以分辨混杂在一起

9、的两个，或两以上外貌近似的品系动物。,近交系动物的特性,近亲交配是实验动物获得遗传均一性的典型方法。使用较少的近交系动物，即可达到统计学要求的精密度。同一近交系的全部动物，在遗传上相同，减少了表现型的变异。在个体之间能互相接受皮肤和肿瘤移植。,近亲交配的意义,近亲交配20代后，同品系的全部个体基因位点纯合性可达到98.6%，在这种纯合性的种群内，不携带不表现的隐性基因。近交系的变化只能是发生突变的结果，而基因突变发生率是很低的。因此，近交系的遗传质量可看作是长期稳定的。,近亲交配的意义,固定基因时，有害的隐性基因也会纯合，出现不利的性状而造成育种失败；近交还可能导致多基因之间丧失平衡，从而使高

10、度纯化的动物对不良环境的调节适应能力降低；近交使动物失去为保持足够生物适合度所必需的最低水平的基因杂合性，从而影响动物生长率，寿命，对疾病的感受性，生活力，体力及繁殖能力。,近亲交配的弊端,鉴于近交系动物具备上述特性，其应用首推遗传学研究，可消除杂合遗传背景的影响，以较少的动物取得较一致的动物实验结果。其次，近交系动物在肿瘤研究工作中应用最广泛，被培养的品系也最多；对肿瘤的病因学、发病学、实验治疗和新抗癌药物的研究等都作出重大贡献。,近交系的应用,在某些涉及组织细胞或肿瘤移植的实验中，个体间组织相容性一致与否，是实验成败的关键。因此，近交系动物成为不可缺少的实验动物。随着生物医学科学研究的发展

11、，已培育成功各种人类疾病的动物模型，如：高血压大鼠、癫痫大鼠糖尿病小鼠、白血病小鼠，白内障小鼠、先天性肌萎缩小鼠、免疫缺陷型小鼠等等。这些近交系动物家系清楚，取材方便，是进行基因连锁分析，比较理想的实验材料。,近交系的应用,概念：Closed colony or outbred stock 以非近交交配方式进行繁殖生产的一个实验动物种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上，称为一个封闭群，或叫远交群。,封闭群（远交群）,封闭群可分为起源于近交系,但并不进行全同胞交配的维持群;起源于非近交系,亦不进行全同胞交配的维持群两类。群体世代间近交系数上升率必须低于1%。这类动物和近交系

12、不同，在动物群体内的个体之间，具有某种程度的遗传学差异。例如ddN小鼠，Wistar大鼠、我国各研究单位长期自行繁殖的KM小鼠、青紫兰兔、新西兰白兔、大耳白兔等均属此类。,封闭群由2-4个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母须大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。,封闭群动物的命名,如：N：NIH表示美国国立卫生研究院（N）保持的NIH封闭群小鼠。Ssmu:KM表示上海第二医科大学保持的KM封闭群小鼠。,封闭群动物的命名,1、基因库大，杂合率高 封闭群是一种长期与外界隔离，雌雄个体间能够随即交配的动物群，其遗传组成比较接近自然状态

13、下的动物群体结构，具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成。其基因的杂合率较高，个体间的基因型不一致，因此，群体基因库较近交系大。,封闭群动物的遗传学特性,2、群体基因频率基本保持稳定 封闭群动物不从其外部引入新基因，又坚持随机交配从而使群体在一定范围内保持相对稳定的遗传特征。群体基因频率可达到哈迪温伯格平衡，,封闭群动物的遗传学特性,1908年提出，数学家哈迪（G.H.Hardy）和医生温伯格(W.Weinberg)分别提出关于基因频率稳定性的见解。在一个有性生殖的自然种群中，在符合以下5个条件的情况下，各等位基因的频率和等位基因的基因型频率在一代一代的遗传中是稳定不变的：种群大；种群中个体间

14、的交配是随机的；没有突变发生；没有新基因加入；没有自然选择。,哈迪温伯格平衡,3、封闭群内的个体差异主要取决于其祖代起源 若封闭群祖代起源于同一个近交系动物，其遗传差异较小。而起源于非近交系的一般封闭群动物，其个体差异较大，且可携带隐性的有害基因，或致死基因，易于诱发突变。,封闭群动物的遗传学特性,鉴于封闭群动物具备上述特性，在遗传学研究中，常作为选择实验的基础群体，供作某性状遗传力的研究。,封闭群动物的应用,封闭群动物的遗传组成具有很高的杂合性,其繁殖力和生活力较强,表现为平均胎产仔数多，胎间隔短，仔鼠离乳率高，生长快，成熟早，抗病力强，寿命长；,生产成本低，可大量供应,广泛用于各种预试验、

15、学生教学和常规的药物筛选和毒性试验中。,回交：一种实验动物与另一种不同遗传特性的近交系交配获得N1，N1带有1/2近交系的基因组成；N1再与该近交系交配得到N2，N2带有3/4近交系的基因组成。,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,如果就这样与近交系进行n次回交，按1-（1/2）n 的概率替换近交系的基因；经7-8次回交，将能得到大体上同近交系具有相同基因组成的新品系。

16、,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,杂交就是将不同的群体或品系动物进行交配。假设近交系A的基因型为A1/A1，B1/B1，C1/C1；近交系B的基因型为A2/A2，B2/B2，C2/C2。两种品系内的血缘系数R=1；而两种品系无共同的祖先R=0。,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,把这两种品系进行杂交，产生F1的基因型是均一的A1/A2，B1/B2，C1/C2；个体各基因位点均是杂合型，又保持了个体遗

17、传均一性，即F1的各个体间血缘系数R=1；还可能出现新的遗传特性。如近交系NZB和NZW的F1中发现了自身免疫性疾病鼠。,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,重组近交系：重组近交系 由两个近交系杂交后，经连续20代以上兄妹交配育成的近交系。重组同类系：由两个近交系杂交后，子代与两个亲代中的一个近交系进行数次回交（通常回交2次），再经无特殊基因选择的近亲交配而育成的近交系

18、。,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,重组近交系命名:由两个亲代近交系的缩写名称中间加大写英文字母X命名。由相同双亲交配育成的一组近交系用阿拉伯数字予以区分。如：由BALB/c与C57BL/6杂交育成的一组近交系分别命名为CXB1、CXB2。,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,重组同类系命名：由两个亲代近交系的缩写名称中间加小写英文字母c命名，其中用作回交的亲代近交系（称受体近交系）在前，供体近交系在

19、后。由相同双亲育成的一组同类系用阿拉伯数字予以区分。如：由BALB/c为受体近交系，以STS为供体近交系（S），经2代回交育成的一组重组同类系分别命名为CcS1、CcS2。,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,应用：重组近交系是实验动物近十年来遗传学的最重要发展成果之一。以两个无关的近交系进行杂交，产生F1后，再兄妹交配连续20代以上育成一组近交系。该组近交系既有其双亲品系的特性，又有重组后每个重组近交系的特性。重组近交系已广泛应用于新的多态性基因位点和新的组织相容性位点的鉴定、多态性位点的多效性及

20、其连锁性的研究；还用于动物寿命、自发性和诱发性疾病的研究；以及生理学、药理学、形态学和行为学等方面的研究,重组近交系和重组同类系,Recombinant inbred strain Recombinant congenic strain,随着生物医学科研的发展及其需要，目前世界上已培育成功数百种近交品系和封闭群动物，加上不同的亚系和新建的突变群，其种（品系）数量愈千。在各科研或教学单位的实验动物饲育繁殖部门，一般都保持几个或几十近交系。而在多个品系动物生产繁殖过程中，无法确保绝对不发生计划外杂交。,实验动物遗传学质量控制,有必要进行实验动物的遗传质量控制,科研人员都希望证明各自所得到的品系动物

21、的遗传背景是符合标准的；,生产繁殖部门希望确证：所提供的实验动物符合遗传控制的质量。,实验动物遗传学质量控制,国际实验动物理事会提出了实验动物质量检测必须符合“4E原则”。,准确 Exact,简便Easy,有效Efficient,经济Economic,实验动物遗传学质量控制,目前常用的检测方法,生化标志基因位点检测,皮肤移植,下颌骨形态学分析,毛色基 因交配测试等,实验动物遗传学质量控制,实验动物的遗传质量控制的意义,每个品系（或种群）的遗传概貌；,定期进行常规质量检测，证明被检动物质量是否符合遗传概貌；,签发品系（种群）的合格证书。,实验动物遗传学质量控制,近交系遗传概貌是指一套生化标志基因

22、位点,根据这些位点可确切无误地判定品系,并将其同其它近交品系,甚至可能只有1-2个位点不同的亚系区分开来。从理论上讲，遗传概貌应至少由每条染色体的3个位点组成：每条染色体着丝点相应的近端和远端各1个位点和中部1个位点。一旦确定了遗传概貌后，检测特定的染色体就能够完成近交系遗传质量的判定。,遗传概貌的确定,封闭群动物遗传概貌内容,繁殖数据 整体分析胎间隔 整体脂肪含量 成活新生数 整体干物质含量离乳仔数 血液学数据幼仔体重（2周龄）血红细胞计数淘汰种鼠特点 血白细胞计数形态测定数据 血红蛋白含量体长 血细胞比容体重 平均细胞容积11个下颌骨测量数据 尺骨长,在确定了近交系动物的遗传概貌后，为了保

23、证遗传质量检测的可靠和完善，又实现“4E原则”，没有必要（也不可能）不停息的对遗传概貌中的所有位点进行检测。执行了检测方案，就能及时发现近交系动物计划外的杂交。方案必须规定检测足够数量的染色体，以利确定被测品系具有相同的基因型。方案必须以对尽可能少的动物的检测结果，实行全同胞质量监测。,遗传质量检测方案的设计,在实验动物国家标准哺乳类实验动物的遗传质量控制（GB14923-2001）中规定：对基础群，凡在子代留有种鼠的亲本动物都应进行检测；对生产群动物每年至少进行一次遗传质量检测，每次应采样6只。,遗传质量检测方案的设计,当前生物化学进展，已能灵敏地测定蛋白质化学结构的微小差异，这些差异由遗传

24、基因决定，是个体及品系固有的特性，可用作鉴定品系和个体的判定。使用电泳技术显示蛋白质不同性状，便能建立每一近交系独特的基因概貌。,生化标志位点测试,经研究，目前实验小鼠至少有64种生化标记（同功酶或蛋白质）位点；在大鼠近交系中，生化标记位点仅有少量的报道。,生化标志位点测试,在实验动物国家标准哺乳类实验动物的遗传质量控制（GB14923-2001）,对近交系小鼠选择位于10条染色体上的13个生化位点,对近交系大鼠选择9个生化位点，作为生化标记检测。,生化标志位点测试,生化标志基因位点测试法是一种得到广泛应用的灵敏的遗传质量检测方法，它能证实近交系和确定亚系间的遗传关系，具有较高的应用价值。该方

25、法必须严格选择每一种显示同功酶的缓冲液，电泳的温度、时间、电压和电流的最佳值。使用这种方法需要一定的技术和设备。,生化标志位点测试,实验证明动物具有接受或排斥所植皮肤的能力。每个近交系的全部个体在遗传上高度纯合，所以，同品系的个体间能互相接受皮肤移植；而不同品系的个体间植皮就会互相排斥。皮肤移植也是的常用的遗传质量检测方法，在国家推荐标准（GB/T14927.2-2001）实验动物近交系小鼠大鼠皮肤移植法中，对该方法的基本操作步骤有详细的介绍和规定。,皮肤移植,小鼠和大鼠的检测中普遍采用的是快速、有效的尾部皮肤移植法。植皮后至少观察100天，只有在100天以上植皮双方均不发生排斥，才能证实待测

26、小鼠或大鼠的遗传纯合性。在对已知品系检测时，若急性排斥占手术例数30%，须重新考虑采样，以确认是技术性还是其他原因造成的结果。,皮肤移植,实验动物皮肤移植规律,皮肤移植法优点：易掌握、高度灵敏、经济、不需昂贵设备、对植皮接果的排斥或接受容易判断。皮肤移植法不足：该方法费时：为检测非H-2组织相容性基因的差异，需观察100天后才能作出判断；饲养植皮动物需一定饲养空间；会出现一些系技术或其他非免疫因素植皮实验失败。该方法不是鉴别新品系的理想方法。,皮肤移植,下颌骨形态是高度遗传的性状，由多态性位点确定。下颌骨的形态和大小在小鼠的近交系间存在明显差异，所以，下颌骨分析是一种合理的方法该方法是一种灵敏

27、和有效的鉴别和检测亚系变异（源于遗传混杂和突变）的技术。正常环境因素及饲养管理对下颌骨形态几乎没有什么影响，50日龄后下颌骨基本上不再生长，其形态也不再发生变化。,下颌骨形态学分析,检测前，制作测量用的标准直角坐标底板，在近交系核心群中随机取60日龄以上的成年雄鼠，每次取样10只为1组，制备下颌骨标本后，在显微镜下，放大10倍测量在直角坐标底板上下颌骨11个形态特征参考点的距离,下颌骨形态学分析,将所测量值的平均数作统计分析，利用判别函数确定下颌骨形态。如果测量值集中，则表明在被测小鼠间无显著的遗传差异。下颌骨形态分析是一种灵敏、经济、简便、可同时检验大量的遗传位点的遗传监测方法。若配以扫描机

28、将下颌骨形态扫入电脑，经电脑测量其形态特征参考点的距离，并由电脑完成统计分析，既可减少人为误差，还可加快统计分析的速度。,下颌骨形态学分析,小鼠毛色主要受A、B、C三个等位基因控制，它们分别在不同的染色体上。cc基因是其他毛色基因的上位基因。白化小鼠cc等位基因是已知的，A，B是待测基因。毛色基因交配测试可把隐性的毛色基因显示出来。,毛色基因交配测试,A-B-C：为野生色A-bbc：为桂皮色aaB-C：为黑色aabbC：为棕色,毛色基因交配测试,根据遗传学原理，被测个体与已知复隐性基因个体交配，可以从F1的毛色判断待测小鼠基因型；如待测小鼠A、B位点是纯合的，则杂交F1的毛色只出现一种颜色。,毛色基因交配测试,通常将60-70日龄待测小鼠雌鼠与已知毛色基因结构的DBA/2（aabbCC）雄鼠交配，根据杂交F1的毛色确定待测小鼠主要毛色基因型，鉴定是否纯合。,毛色基因交配测试,