实验三Feulgen反应显示DNA.ppt
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1、实验三Feulgen反应显示DNA,一、实验目的,1掌握临时制片法。2熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。3观察细胞中DNA的分布,二、实验原理,DNA经酸(1mol/L HCl)水解后,分子中的嘌呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开,脱氧核糖的一端释放出游离的醛基,并在原位与Schiff试剂反应形成特异性的紫红色产物。该产物能特异地吸收550570nm的光波。并且在一定的浓度范围内对550570nm光波的吸收值与DNA含量成正比关系,符合化学计量学关系。对照组或采取不经盐酸处理,或预先用热三氯醋酸或DNA酶处理,抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应,从而证明此反应的专一性。此法既可定位用于细胞或
2、组织化学染色反应,观察DNA的分布,又可用显微分光光度计和图像分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量分析。,1950年,Swift H.应用Feulgen显微分光光度法,测定了一些生物各种组织中单个细胞的DNA含量,定义为C值。Feulgen反应对DNA染色稳定、颜色鲜明、能定量,因此在细胞化学和组织化学中成为一个既古老、传统又经久不衰的DNA标记方法。,Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠/钾作用,形成无色的品红液。无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物,这是因为反应产物的分子内含有发色基团醌基所引起的。,三、实验器具与药品,l 每一个学生复式显微镜(带油浸物镜)(microscop
3、e)l 每一组学生擦镜纸;记号笔;小片滤纸;载玻片;镊子;移液枪四膜虫培养液(200l);大染色缸:Carnoy固定液;Schiff试剂(铝箔包装);1mol/L HCl;自来水l每四个学生香柏油、二甲苯;小枪头;亮绿整个实验班恒温水浴锅两台,烘箱一台,四、实验方法1、细胞标本的制作:,(1)每个同学取一片干净载玻片,用移液枪取四膜虫培养物一滴(每片载玻片10 l,移液枪切勿调节超过其量程范围),滴于干净的载玻片的一侧,并用枪头在玻片上涂开成直径约1cm左右的圆。(2)按上述方法再做一片细胞标本作为对照。(3)将标本放在干燥箱中10-15分钟,令样品干燥,细胞牢固贴于玻片。每人做两片:样品;对
4、照,染色缸平面示意图,载玻片,2固定、染色、观察:,以下17步操作在染色缸中进行。(注意:载玻片插入染色缸中应插在凹槽中,尽量避免两片载玻片贴在一起,否则会摩擦掉上面的细胞。)(1)将干燥好的2片细胞涂片置于Carnoy固定液中固定20分钟,取出,平置在滤纸上,吸去玻片背面的液体。(滤纸不要擦载玻片正面。)(2)将其中一片标本(样品)放入1mol/L盐酸中,60水浴15分钟(注意不要打翻染色缸);另一片标本(对照)放在空气中,令其自然干燥。(3)将以上两标本同时放入Schiff氏液中作用45分钟(30培养箱)。(注意不要搞混样品和对照。)(4)自来水浸泡1分钟,提出载玻片,平置在滤纸上。(5)
5、倒去染色缸中液体,再加入干净的自来水,重复(4)操作。(6)0.1亮绿水溶液复染2秒钟(将载玻片浸入溶液后随即提出)。(7)在干净的自来水稍加浸泡,去掉浮色,滤纸吸去玻片背面和两侧的水分。(滤纸不要擦载玻片正面)(8)空气中干燥,显微镜观察。比较两个标本的差异。,实验流程,涂片(2片/人),样品,对照,干燥,盐酸水浴6015m,Schiff试剂3045m,对照片空气干燥,自来水浸洗1m/两次,亮绿复染 2s,Carnoy固定20m,自来水浸洗去浮色,干燥,镜检,介绍:RNA染色Brachet反应,甲基绿-派洛宁为碱性染料,它能分别于细胞内的DNA和RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为
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