天然药物化学成分提取分离鉴定方法.ppt

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1、第二章,天然药物化学成分提取分离鉴定的方法与技术,1,2,3,内 容,第一节 提取方法与技术第二节 分离精制方法与技术第三节 结构研究方法与技术,4,第一节 提取方法与技术,常用的方法有：一、溶剂提取法（最常用）二、水蒸气蒸馏法三、升华法四、超临界流体萃取法,提取：选择适宜的溶剂和适当的方法，将所要的成分尽可能完全地从天然药物中提取出来，而杂质尽可能少地被提出的过程。,5,一、溶剂提取法,（一）定义：指根据天然药物中各化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当的方法将所需化学成分尽可能完全从药材组织中溶解提出的方法。,在实际工作中应用最普遍,6,7,溶剂对药材

2、组织细胞不断作往返的扩散、渗透、溶解，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达平衡。,扩散、渗透、溶解,（二）基本原理：“相似相溶”亲脂性的成分易溶于非极性的溶剂中，亲水性的成分易溶于极性的溶剂中。,（三）溶剂的极性,8,与介电常数有关，介电常数越大，极性越大。,极性从低到高的顺序依次是：,9,水,极性,低,高,亲脂性有机溶剂,亲水性有机溶剂,与水分层的有机溶剂?能与水分层的极性最大的有机溶剂?与水可以以任意比例混溶的有机溶剂?极性最大的有机溶剂?极性最小的有机溶剂?,?,1、水：为极性最大的溶剂，适用于提取水溶性成分。如：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、鞣质、小分子有机酸、有

3、机酸盐、亲水性色素、无机盐。其中蛋白质不溶于热水。优点：价廉、安全、无毒、对组织穿透力强。缺点：提取液易发霉，蒸发浓缩耗能大，含多糖类原料过滤困难。,10,常见溶剂的适用范围,2、亲水性有机溶剂（丙酮、乙醇、甲醇）：以乙醇最常用。提取范围较广，除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉、部分多糖和油脂等外，大多天然药物化学成分能在乙醇中溶解。优点：对组织细胞穿透力强，提取全面，毒性小，易过滤，不霉变，易浓缩回收。缺点：价高、易燃，需回流设备。,11,3、亲脂性有机溶剂：与水不相混溶的石油醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂。用以提取挥发油、苷元、蒽醌类、游离生物碱、黄酮等亲脂性成分。优点：提取专属性强（提出物较

4、纯，杂质少）,易回收浓缩。缺点：价高、易燃、有毒、穿透性差、对设备要求高。,12,（四）溶剂选择的原则,13,基本要求：1、对所提取成分的溶解度大，对杂质的溶解度小；2、对目标组分不起化学反应；3、经济易得，低毒安全，使用方便；4、沸点适中，易回收。,选择适当的溶剂是提取步骤的关键。主要根据溶剂的极性、被分离成分的性质、共存的其它成分（杂质）的性质三个方面。,（五）操作方式,1、浸渍法2、渗漉法3、煎煮法4、回流提取法5、连续回流提取法6、超声提取法,14,根据目标组分的极性、热稳定性、挥发性和溶剂的性质等选用合适的方式。,1、浸渍法：,将药材用适当的溶剂在常温或温热（40-60）的情况下浸泡

5、一定时间，以溶出其中成分。,15,乙醇(最常用)水（酸/碱）,粉碎好的药材放入提取用的容器中，加入溶剂使没过药面，浸泡。滤出溶剂，加入新的溶剂继续提取（多重浸渍）。,加入溶剂浸泡,浸泡后,浸渍法,17,本法适用于有效成分遇热易破坏以及含大量淀粉、树胶、果胶、粘液质等多糖药物的药材的提取。优点：操作方便，简单易行。缺点：浸出效率较低，故对贵重、有效成分含量低、需制成高浓度制剂的药材的提取不宜采用；耗时长，溶剂用量大，水提液易发霉。,浸渍法,2、渗漉法：,将药材粉末装在渗漉筒中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉筒下部流出浸出液的一种浸出方法。本法适用于有效成分遇热易破坏的药材及有效成

6、分含量低的药材。优点：提取效率较高，浸出液较澄清。缺点：耗时长，溶剂用量大，操作麻烦。,18,动态提取良好的浓度差,渗漉法,连续渗漉装置,提取溶剂,粉碎药材,棉花或纱布,渗漉液,3、煎煮法（热提取，只能用水做溶剂）：,煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。适用于有效成分能溶于水且不易被水、热破坏的天然药物的提取。优点：简便易行。缺点：提出杂质多；不能用于提取含挥发油成分及遇热不稳定性成分的提取；含多糖类丰富的药材，因煎液粘稠，难以滤过。,20,21,煎煮法,“加水煮沸，去渣取汁”,4、回流提取法：,用低沸点、易挥发的有机溶剂加

7、热提取天然药物中有效成分时，需采用回流提取法以减少溶剂的挥发损失，提高浸出效率。,22,乙醇、甲醇、三氯甲烷、苯,适用于脂溶性较强的天然药物化学成分的提取。,23,回流提取法,优点：提取效率较高。缺点：受热时间较长，不能用于热不稳定性成分的提取；且溶剂消耗量仍大，操作较麻烦。,5、连续回流提取法：,为了弥补回流提取法中需要溶剂量大，操作较烦琐的不足，可采用连续提取法，即用最少量溶剂最大限度地提出有效成分。适用范围：脂溶性化合物。装置：脂肪提取器或称索氏提取器。,24,25,连续回流(索氏提取),优点：提取效率最高，最节省溶剂。缺点：回流时间长（4-10 h），不能用于热不稳定性成分的提取。,6

8、、超声提取法,原理：利用超声波的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放；超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散；同时超声波的热效应使水温基本在57，对原料有水浴作用。提取速度快、时间短、收率高、无需加热。,是一种利用超声波浸提有效成分的方法。,26,助溶,1、溶剂性质2、操作方式（方法）3、药材粉碎度4、温度5、时间6、其他因素,27,（六）影响提取的因素,选择合适的溶剂和操作方式是关键！,二、其他提取方法,水蒸气蒸馏法,28,是将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。,道尔顿分压定律：P=P水+P不溶物质,P等于外界大气压的

9、时候，混合物沸腾。因此在常压下应用水蒸气蒸馏，能在低于100的情况下将高沸点组分与水一起蒸出。,29,水蒸气发生部分,蒸馏部分,冷凝部分,接收器,进行水蒸气蒸馏的物质必须具备以下三个条件：,30,该法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取。主要用于挥发油的提取。,1、不溶或难溶于水；2、共沸下与水不发生化学反应；3、在100左右时，必须具有一定的蒸气压。,31,升华法,有些固体物质受热后会直接汽化，遇冷后又凝固为原来的固体化合物，该现象称之为升华。对于具有升华性质的有效成分，可采用升华法提取。如从樟木中提取樟脑，从茶叶中提取咖啡因。,此法简单易行，但在实际提取时很少采用。

10、因为升华所需温度很高，中草药容易炭化，炭化后产生的挥发性的焦油状物，容易黏附在升华物上，不易精制除去；其次，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。,32,超临界流体萃取法（SFE）,利用超临界流体优良的溶解性能对成分进行提取和分离的新技术。,特点：流体密度近似液体，粘度与气体相似。扩散力和渗透性优于液体，介电常数随压力增大而增加，有利于溶质的萃取，无溶剂残留。,常用作超临界流体的物质：二氧化碳、氧化亚氮、乙烷、乙烯和甲苯等。,表1、天然药物提取方法小结,33,第二节 分离精制方法与技术,34,天然药物粗提液是多种物质的混合，需要进行进一步的分离和精制。,分离精制前需浓缩提取液，减压蒸馏为最

11、常用的方法。,“去其糟粕，取其精华”,旋转蒸发仪,35,一、系统溶剂分离法：溶解度差异二、两相溶剂萃取法：分配比差异三、沉淀法：溶解度/酸碱度差异四、结晶与重结晶法：溶解度差异五、透析法：分子大小差异六、分馏法：沸点差异七、色谱法：吸附、分配以及亲和力差异,分离依据：共存成分的性质差异,寻找差异利用差异,一、系统溶剂分离法,是一种按极性由小到大的顺序，选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次分离提取液中各种不同成分，使各溶解度有差异的成分得到分段分离的方法。,表3、天然药物成分及其较适用的提取分离溶剂,37,38,二、两相溶剂萃取法,39,原理：利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的差

12、异而达到分离的方法。分配系数 K=CU/CL CU、CL 分别为溶质在上相、下相的平衡浓度。K相差越大,分离效率越高。,举例：A、B两种溶质在CHCl3/H2O中进行分配，如A、B均为1克，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比为VCHCl3/VH2O=1，在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，90%以上的溶质A将分配在上相溶剂（水）中，不到10%的A分配到下相溶剂（氯仿）中。同样的道理，溶质B分配将与A相反。,分离难易与分离因子,40,100时 一次简单萃取即可将二者分开;100 10时，需萃取1012次;2宜用逆流分溶法;1不能用本法分离。,定义：A、B 两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比

13、值(注：KAKB)。分离因子=KA/KB,越大,两种溶质越易分离。,分配比与pH,41,对酸性、碱性及两性化合物来说，分配比还受溶剂系统pH的影响。因为pH的变化可以改变它们的存在状态（游离型或解离型），从而影响在溶剂系统中的分配比。,?如何利用,萃取溶剂的选择,42,萃取分离必须满足两个条件：（1）两相溶剂必须互不相溶；（2）被分离各成分有不同分配系数。,1、简单萃取法,2、pH梯度萃取法,3、逆流连续萃取法,4、逆流分溶法,两相溶剂萃取常用方法与技术,43,1、简单萃取法:,萃取操作原则：“少量多次”。操作注意（1）水提液的相对密度应在之间。（2）防止乳化。,44,实验室用分液漏斗;一般在

14、水和亲脂性有机溶剂中进行。,45,2、pH梯度萃取法：,利用不同成分的酸碱性的差异，在某一定pH下，某些成分可以成盐或游离，改变该成分在溶剂系统中的分配系数而与其它成分分离。,3、逆流连续萃取法,原理：利用两相互不相溶的溶剂相对密度的不同，使相对密度小的液相做为移动相，逆流穿过相对密度大的作为固定相的相液，借以交换溶质而达到分离的目的。优点：操作简单、避免乳化、溶剂用量小、萃取效率高。,46,例如：用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素。将氯仿盛于萃取管内，而比重小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内，开启活塞，则水浸液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大，萃取就比较

15、完全。,47,逆流连续萃取法,如果一种药材的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。,48,4、逆流分溶法,此法相当于多次萃取，对于分离具有非常相似性质的混合物效果较好。50时采用。,在No.0漏斗中溶入溶质并加入流动相。振摇使两相溶剂充分混合，静置分层后，分出流动相，令其移入No.1管，再在No.0管中补加新鲜流动相，再次振摇混合，静置分层并进行转移。如此连续不断地操作下去，溶质即在两相溶剂中，不断地重新分配并达到分离的目的。,49,三、沉淀法,指在天然药物的提取液中加入某些试剂，使部分物质生成沉淀或降低溶解性而从溶液中析出，从

16、而获得有效成分或去除杂质的方法。,1、酸碱沉淀法,50,通过加入酸、碱以调节溶液pH值改变分子的存在状态，从而改变溶解度而达到分离的目的。,50,51,A酸/碱法（酸提取碱沉淀法）生物碱的提取、纯化,52,B碱/酸法（碱提取酸沉淀法）黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化,53,2、试剂沉淀法：利用一些成分能与某些试剂产生沉淀的性质，或利用某些成分在不同溶剂中溶解度的差异，通过加入特定试剂或者溶剂，使生成沉淀，从而与其他成分分离。,举例1：在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂（见生物碱性质下），则生物碱生成不溶性复盐而析出。水溶性生物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀

17、析出。胆固醇与甾体皂苷生成沉淀；蛋白质与鞣质形成沉淀等。,化学反应试剂生成不溶性物质,54,水提醇沉法：除去多糖、蛋白质、淀粉、无机盐等水溶性杂质。醇提水沉法：除去脂溶性的油脂、树脂、叶绿素等水不溶性杂质。,天然药物中大多数化学成分易溶于水和醇。,加入极性不同试剂改变溶解度,举例2：,3、铅盐沉淀法,55,铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。中性醋酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐。脱铅法：（1）硫化氢脱铅法（PbS沉淀）（2）硫酸、磷酸及其钠盐脱铅法（3）离子交换

18、脱铅法,四、结晶和重结晶法,56,结晶和重结晶是利用固体混合物中各种成分在溶剂中的溶解度的差别，使所需成分以结晶状态析出，达到分离精制的目的,可获得较纯的单体。,使物质从液态或气态形成晶体的方法即结晶法。将不纯的结晶进一步精制成较纯的结晶的过程称重结晶。在溶液中，溶质的过饱和是其结晶的驱动力，天然药化最常采用的结晶法为降温结晶法。,结晶溶剂的选择,57,（1）不与结晶物质发生化学反应；（2）对结晶物质的溶解度随温度不同有显著差异，热时溶解度大，冷时溶解度小；对可能存在的杂质溶解度非常大或非常小；（3）沸点适中，不宜过高或过低（35135）。常用溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等；

19、（4）若无理想单一溶剂时，还可用混合溶剂。,采用试验的方法选择合适的溶剂,58,例如：取0.1g目标物质于一小试管中，滴加约1mL溶剂，加热至沸。若完全溶解，且冷却后能析出大量晶体，这种溶剂一般认为合用。如样品在冷时或热时，都能溶于1mL溶剂中，则这种溶剂不合用。若样品不溶于1mL沸腾溶剂中，再分批加入溶剂，每次加入0.5mL，并加热至沸。总共用4mL热溶剂，而样品仍未溶解，这种溶剂也不合用。若样品溶于4mL以内的热溶剂中，冷却后仍无结晶析出，这种溶剂也不合用。,如果难于选择一种适宜的溶剂，可考虑选用混合溶剂。混合溶剂一般由两种能互相溶解的溶剂组成，目标物质易溶于其中之一种溶剂，而难溶于另一种

20、溶剂。,59,食盐晶体,单晶冰糖,薄荷醇晶体,小檗碱晶体,结晶的条件：溶剂、杂质的去除、有效成分的含量、溶液的浓度、温度、时间等。,60,判断结晶纯度的方法：1、晶形、色泽（初判）；2、熔点测定：纯品熔距小；3、薄层色谱法：用三种以上不同展开系统，只出现一个斑点时可初步判断为单一成分；4、光谱测定（紫外光谱、红外光谱）,待分离混合物,饱和溶液,结晶,粗结晶,溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，热过滤,放置（冷藏）析晶，过滤,重复上述操作（重结晶）,结晶操作步骤：,注水孔：加入水的高度为漏斗高度的的3/4-4/5,酒精灯加热处,手 柄,铁夹固定处,62,热滤漏斗,放入短颈玻璃漏斗和菊花形滤纸一起加热

21、,热过滤操作示意图,63,五、透析法,利用透析膜具有选择性透过特点，使提取液中小分子物质可顺通过透析膜，而大分子物质不能通过，从而使分子量差异较大的物质获得分离的方法。,64,适用于分离纯化天然药物化学成分中的大分子物质，如皂苷、蛋白、多肽、多糖等。,六、分馏法,利用各沸点不同的化合物，在分馏过程中产生高低不同的蒸气压，从而收集到不同沸点温度的馏分,达到分离的目的。,65,一般情况下，液体混合物沸点相差100以上时，可用蒸馏法；沸点相差25以下时，需用分馏柱；沸点相差越小，则需要的分馏装置越精细。,适用于分离天然药物中得到的沸点相差比较小的液体混合物。如挥发油、一些液体生物碱的分离。,66,简单分馏装置,分馏柱,七、色谱法（下一次课）,67,薄层色谱,柱色谱,纸色谱,思考题,1、天然药物有效成分的提取方法主要有哪几种？选择的依据是什么？2、溶剂提取的操作方法有哪些？各有何特点？3、如何选择合适的重结晶溶剂？4、两相溶剂萃取法是依据什么原理进行的？在实际工作中如何选择溶剂？,68,69,浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法，其使用范围及特点见下表：,70,71,谢 谢！,