制药工艺学第十八章-维生素的生产工艺.ppt

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1、第四篇 药物制备工艺学,第十八章 维生素发酵生产工艺,定义：维生素是一类生物生长发育起调节作用的、化学结构不同的、小分子有机化合物，人体内不能合成，必须从食物等中摄取。,18.1 概 述,维生素有以下特点：（1）维生素是天然食物中的一种成分，是一种活性物质，对机体代谢起调节和整合作用。（2）维生素需求量很小。（3）大多数维生素在体内不能合成，要从外界摄取。（4）绝大多数维生素是通过辅酶或辅基的的形式参与体内酶促反应体系。（5）人体内维生素缺乏时，会发生一类特殊的疾病，称“维生素缺乏症”。维生素并不是补品，人体每日需要量是一定的，多摄入并不一定好，使用不当，反而会导致疾病。,概 述,维生素分为脂

2、溶性和水溶性两大类。脂溶性：维生素A，D，E，K，Q和硫辛酸等。水溶性：维生素B1、B2、B6、B12、烟酸、泛 酸、叶酸、生物素和维生素C等。,概 述,维生素的分类,5,名称,学名及俗名,生物作用,维生素A族,视黄醇,抗干眼病,维生素D2,麦角钙化醇,抗软骨病,维生素D3,胆钙化醇,抗软骨病,维生素E族,生育酚,抗不育,维生素F族,亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸,降胆固醇及防血栓,维生素K族,叶绿醌，合欢醌，甲基萘醌,抗出血,维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。,水溶性维生素,名称,学名及俗名,生物作用,维生素B1,硫胺素,抗神经类,维生素B2,核黄素,抗口角溃疡，唇炎维生素B3族（维

3、生素PP）,烟酸，烟酰胺,抗糙皮病,维生素B5,泛酸,抗癞皮病,维生素B6族,吡哆醇，吡哆醛，吡哆胺,抗皮炎,维生素B9族,叶酸，黄嘌呤，赤嘌呤，蝶酸等,抗恶性贫血,维生素B12,钴胺素，氰钴氨素，羟钴胺素等,抗恶性贫血,维生素B13,乳清酸,抗早衰,维生素BT,L肉碱,营养强化剂,维生素C,抗坏血酸,抗坏血病,维生素H,（维生素B8）,生物素抗毛发脱落及脂肪代谢混乱,维生素与辅酶、辅基的关系 长期以来，人们就认识到食物中缺乏某种维生素，会导致某种疾病，维生素在机体的代谢中起着十分重要的作用，后来陆续发现大部分维生素或者其本身就是辅酶、辅基，或者是辅酶、辅基的组成部分。例如维生素B1（硫胺素）

4、，它在体内的辅酶形式是硫胺素焦磷酸（TPP），是酮酸氧化脱羧酶的辅酶，又如泛酸，其辅酶形式是COA，是转乙酰基酶的辅酶。,概 述,生产方法（1）化学合成法 烟酸、烟酰胺、叶酸、维生素B1、B6、D、E、K等。（2）发酵法 B12、B2，维生素C和生物素，维生素原等。（3）生物提取法 从猪心中提取辅酶Q10，从槐花米中提取芦丁，从提取链霉素后的废液中提取B12等。,概 述,生产工艺,主要维生素的生产有三种方法。1.微生物发酵和微藻类的生物转化法（统称生物合成法）发展非常快。2.化学合成法是目前生产维生素得主要方法。3.天然提取法是从富含维生素的天然食物或药用植物中浓缩、提取而得。目前只有极少数得

5、维生素采用提取法。如维生素A原、维生素E等。,脂溶性维生素工业生产状况,水溶性维生素工业生产状况,现状 2001年维生素H投产成功，我国成为世界上极少数能够生产全部维生素品种的国家。2002年我国维生素原料产量达8.2万吨，其中维生素C超过5万吨，成为世界上最大的原料药生产国和出口国。维生素制剂年产量260280亿支/片/瓶，以片剂、注射液和胶囊为主。,中国科学院上海生物技术研究所发明了维生素C的两步发酵法，使国内维生素C的生产技术达到世界先进水平。湖北广济药业公司对维生素B2实验室发酵生产技术的进一步改进，使其实现了维生素B2工业化的规模生产。浙江新和成股份有限公司在国内首先实现了维生素E中

6、间体三甲基氢醌和异植物醇的工业化生产，打破了国外维生素巨头的技术垄断。中科院攻克的维生素D3生产新工艺，使国内维生素D3的成本低于国外同类产品10%15%。维生素中生产难度最大的产品维生素H在浙江医药股份有限公司及新和成公司研制成功，填补了维生素产品国产化的一个空白。,2005年6月，浙江鑫富收购了湖州狮王，一跃成为全球D-泛酸钙的龙头。现在，占据了国际50%的市场和国内90%市场的鑫富药业在有效消化国际市场上部分存量后，自去年下半年开始对产品进行试探性提价，目前已累计上涨超过80，充分证明了公司在国际上的定价能力。广济药业核黄素（维生素B2）国内外市场占有率也达到了85%和35%。目前年产能

7、超过2500吨，2007年计划将核黄素产能扩大到3000吨。Vc自91起中国就逐渐成为全球的生产基地，仅东北制药一家就占全球20%的市场份额，而目前的上涨主要是由于中国各主要VC生产厂限制产量所至，这也充分说明了中国在国际市场中的定价能力。,18.2 维生素C的生产工艺,18.2.1 概述维生素C又称抗坏血酸(ascorbic acid)，能参与人体内多种代谢过程，使组织产生胶原质，影响毛细血管的渗透性及血浆的凝固，刺激人体造血功能，增强机体的免疫力。另外，由于它具有较强的还原能力，可作为抗氧化剂，已在医药、食品工业等方面获得广泛应用。现状 维生素C（vitamin C）是目前世界上产销量最大

8、，应用范围最广的维生素产品。目前全世界维生素C的产量约为10万吨/年，全球市场销售额5亿美元。,维生素的化学结构和性质 维生素C(多羟基不饱和内酯衍生物)分子中有两个手性碳原子，故有4种光学异构体，其中L（+）抗坏血酸效果最好，其他三种临床效果很低或无效。,维生素的化学结构和性质 白色粉末，无臭、味酸、熔点190-192，易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一种还原剂，易受光、热、氧等破坏，尤其在碱液中或有微量金属离子存在时，分解更快，但干燥结晶较稳定。,生产工艺,莱氏化学合成法 二步发酵法,工艺路线发展,莱氏法化学合成（1933年莱氏(Reichstein)）莱氏法是维生素

9、C生产的经典方法，是由Reichstein和Grussner研究开发的。以D-葡萄糖作为起始原料，经催化加氢制成D-山梨醇，再经醋杆菌深层发酵氧化制得收率很高的L-山梨糖，L-山梨糖经丙酮和硫酸处理（生产上俗称丙酸化）生成双丙酮-L-山梨糖（简称双酮糖），再用苯或甲苯提取，提取液经水法除去单酮山梨糖后蒸去溶剂而后分离出来，用高锰酸钠氧化、水解、酯化、转化、中和便得Vc。,维生素C生产工艺,18.2.3.2 莱氏法化学合成工艺,18.2.3.2 莱氏法工艺路线,维生素C生产工艺,莱氏法工艺过程 山梨醇发酵菌种 醋酸杆菌属可使山梨醇氧化成山梨糖。发酵条件 温度为26-30，最适pH为。pH4.0以

10、下菌的活性受影响。用0.5%酵母浸膏为主要营养源，山梨醇浓度为19.8%，通气量1800ml/min，30培养33h，山梨糖收率可达97.6%。氮源：无机氮源不能利用，使用有机氮源。金属离子的影响：Ni2+、Cu2+能阻止菌的发育，铁能妨碍发酵，为了使发酵顺利进行，需用阳离子交换树脂将山梨醇中的金属离子去掉。,整个合成过程中必须保持第4位碳原子的构型不变；维生素C的总收率约60%。-国外工艺中主要采用 C-4内酯化、C-2烯醇化：酸转化：配料比2-酮基-L-古龙酸：38%盐酸：丙酮=1：0.4：0.3（质量/体积）碱转化：先形成2-酮基-L-古龙酸甲酯，加NaHCO3 转化生成维生素C钠盐，经

11、氢型离子交换树脂酸化，在50-55下减压烘干，得粗品维生素C。,18.2.3.3 两步法发酵工艺,维生素C的化学合成方法一般指莱氏法，后来人们改用微生物脱氢代替化学合成中L山梨糖中间产物的生成，使山梨糖的得率提高一倍，我国进一步利用另一种微生物将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，再经化学转化生产维生素C，称为两步法发酵工艺。这种方法使得维生素C的产量得到大幅度提高。,两步发酵法,两步发酵法是相对莱氏法而言的，即山梨醇发酵生成山梨糖后，山梨糖又经第二步细菌氧化，直接生成2-酮基-L-古龙酸，而废除了丙酮化和化学氧化两个步骤。反应过程为D-葡萄糖催化加氢制山梨醇，山梨醇经发酵生成L-山梨糖，再

12、经第二步发酵到2-酮基-L-古龙酸。,18.2.3.3 两步法工艺,两步发酵工艺,目前维生素C的生产主要采用两步发酵法。即以葡萄糖为原料，经高压催化氢化制备山梨醇，然后以山梨醇为原料经两步微生物（黑醋菌、假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合菌株）发酵制备2-酮基-L-古龙酸，再将此酸酸（或碱）转化等工序制得粗品维生素C，粗品维生素C经精制得成品Vc。,两步发酵的工艺,1 D-山梨醇的化学合成 50%葡萄糖溶液在75下加入活性炭，用石灰乳液调节pH8.4，加镍催化剂，通氢气，压力3.43MPa，反应温度140。反应结束后，静置沉降出去催化剂，反应液经离子交换树脂、活性炭处理后，减压浓缩，得到含量6

13、0-70%的D-山梨醇，无色透明或微黄色透明粘稠液体，收率约97%。,2 2-酮-L-古龙酸的微生物发酵 第一步发酵：黑醋酸杆菌（从D-山梨醇到L-山梨糖）第二步发酵：葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌混合培养发酵罐：气升式反应器，100立方米。（3）2-酮-L-古龙酸的分离纯化 发酵液中：2-酮-L-古龙酸8%，杂质有菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等。除杂操作：加热、离心。,莱氏法是最早生产维生素C的方法,其以葡萄糖为原料,先经黑醋菌发酵生成L-山梨糖,再经丙酮化及NaClO 氧化、水解得到2-酮-L古龙酸钠,然后进行化学合成得到维生素C。此法存在着很多缺陷,如生产工艺复杂、劳动强度大、生产环境恶劣

14、、易对人体造成伤害,因此人们不断对此工艺进行改进。,18.2.3.3 二步发酵菌种及发酵工艺,18.2.3.3.1 第一步发酵A.菌种一步发酵中所用菌种为黑醋酸杆菌（Gluconobacter melagenus），简称黑醋菌。最常用的生产菌株为R-30，其主要特征是：细胞椭圆至短杆状，G+，无芽孢，大小为（0.50.8）m（1.02.2）m。端生草根鞭毛运动，菌落边缘整齐，微显浅褐色。生长最适温度为3033，氧化D-山梨醇的发酵收率可达98以上。,B.培养基,C.发酵过程特征 在发酵过程中，控制发酵温度34，初始pH5.15.3。该氧化反应的耗氧量较大，所以通气比要求1:1 VVM以上。即使

15、在通气量较大，且搅拌转速较高的条件下，发酵至4h后溶解氧浓度急剧下降，甚至接近于零。直到10h左右才逐渐回升。当溶解氧浓度回复至最高点，呈水平直线时，表示该反应已达终点。该发酵过程受山梨醇底物浓度的影响，当其浓度超过250 g/L时，底物对产物形成有抑制作用。故要获得高浓度山梨糖时，必须采用流加发酵方式。为了配合第二步的高浓度山梨糖流加发酵工艺，尽可能提供一步发酵的最终山梨糖浓度是至关重要的。目前山梨糖浓度可达450 g/L,18.2.3.3.2 第二步发酵,菌种 第二步发酵采用的菌种为由大、小两株细菌组成的混合菌种。小菌为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans），大菌可

16、采用巨大芽孢杆菌（Bacillus megateriam），称2980菌，或蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），称152菌，或浸麻芽孢杆菌（Bacillus macerans），称169菌。也可采用其他一些杆菌与小菌混合培养。工业生产过程中使用最多的为2980及152混合菌。氧化葡萄糖酸杆菌的主要特征为：细胞椭圆至短杆状，G-，无芽孢。30培养2d后大小为（0.50.7）m（0.61.2）m，单个或成对排列。在葡萄糖培养基上生长极微弱，甘露醇培养基上生长良好。,B.培养基,C.发酵过程特征,第二步发酵为混合菌种发酵。由于大、小菌两者的最适培养条件是不同的，所以其操作适宜条件是兼顾大

17、、小菌两者的条件。通常操作温度为30；初始pH控制在6.8左右。该反应虽属氧化反应，但对氧的消耗并不很大。气升式发酵罐非常适合该发酵过程。溶氧浓度控制在20即可。山梨糖的初始浓度对产物的生成影响较大。间歇发酵时初始山梨糖浓度超过80 g/L，会对产物生成产生抑制。所以需采用高浓度山梨糖流加发酵方式。若采用建立在数学模型基础上的流加控制策略，二步收率可达83。,2-酮基-L-古龙酸的分离原理,山梨醇经两步微生物发酵主要生成2-酮基-L-古龙酸，使发酵液酸度提高，为了保证产酸正常进行，必须定期滴加灭菌的碳酸钠溶液调pH值，使pH值保持7.0左右，这样发酵终点所得溶液是含古龙酸钠及少量古龙酸的发酵液

18、。在发酵终点时，用于发酵的芽孢杆菌菌体已逐步自溶成碎片，使大量的菌体蛋白溶入发酵液中。因此，发酵液中除了含有一定量的2-酮基-L-古龙酸钠及2-酮基-L-古龙酸外，还含有大量的菌体蛋白。,要将2-酮基-L-古龙酸钠从发酵液中分离提取出来，必须先除去菌体蛋白。除去菌体蛋白，可将发酵液用盐酸酸化调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀，静置数小时后去掉菌体蛋白。除去菌体蛋白的发酵液中含2-酮基-L-古龙酸钠及2-酮基-L-古龙酸，由于2-酮基-L-古龙酸钠（能解离为阴、阳离子），用732阳离子交换树脂进行交换可去掉其中Na+而得2-酮基-L-古龙酸稀液。高温下2-酮基-L-古龙酸不稳定，所以为了浓缩古龙

19、酸溶液使其达到一定浓度，可采用减压浓缩的方法。由于 低温下2-酮基-L-古龙酸溶解度较小，所以可经冷却结晶得2-酮基-L-古龙酸晶体，从而实现了从发酵液中提取分离2-酮基-L-古龙酸的操作过程。,1工艺过程 2-酮基-L-古龙酸的制备工艺过程如下图所示：,（1）离子交换 将发酵液冷却后用盐酸酸化，调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀。静置数小时后去掉菌体蛋白，将酸化上清液以(23)m3/h的流速压入一次阳离子交换柱进行离子交换。当回流到pH3.5时，开始收集交换液，控制流出液的pH值，以防树脂饱和，发酵液交换完后，用纯水洗柱，至流出液古龙酸含量低于1mg/ml以下为止。当流出液达到一定pH值时，

20、则更换树脂进行交换，原树脂进行再生处理。,18.2.3.3 酮基-L-古龙酸的制备工艺,将经过一次交换后的流出液和洗液合并，在加热罐内调pH至蛋白质等电点，然后加热至70左右，加0.3%左右的活性炭，升温至9095后再保温(1015)min，使菌体蛋白凝结。停搅拌，快速冷却，高速离心过滤得清液。将酸性上清液打入二次交换柱进行离子交换，至流出液的pH1.5时，开始收集交换液，控制流出液pH1.51.7，交换完毕，洗柱至流出液古龙酸含量在1mg/ml以下为止。若pH1.7时，需更换交换柱。（2）减压浓缩结晶 先将二次交换液进行一级真空浓缩，温度45，至浓缩液的相对密度达1.2左右，即可出料。接着，

21、又在同样条件下进行二级浓缩，然后加入少量乙醇，冷却结晶，甩滤并用冰乙醇洗涤，得2-酮基-L-古龙酸。如果以后工序使用碱转化，则需将2-酮基-L-古龙酸进行真空干燥，以除去部分水分。,（1）pH值 发酵液在上柱之前pH值非常重要，因为调好等电点是凝聚菌体蛋白的重要因素。pH偏高偏低都会使上柱发酵液中的蛋白含量升高，进而污染交换树脂，使离子交换效率下降。（2）交换液流速 交换液流速过小，树脂处理能力下降，流速过快，交换效率会下降，因此交换液流速的确定要保证有较高的交换率的前提下，提高树脂层的处理能力，生产上一般维持在(23)m3/h。（3）树脂的再生程度 树脂再生的好坏直接影响2-酮基-L-古龙酸

22、的提取，标准为进出酸差小于1%、无Cl。（4）浓缩温度 浓缩温度取决于真空度，真空度高浓缩温度低，但动力消耗大，汽化量大容易跑料；真空度低时，浓缩温度高，料液易炭化。生产上一般控制在45左右较好。,2工艺控制及影响因素,18.2.3 两步发酵法 优势,1.以生物氧化代替化学氧化，省掉了酮化反应；2.节约了大量易燃、易爆、有毒的化工原料，大大减少了“三废”处理，改善了劳动条件，利于安全生产；3.减少工业用粮、生产工序和生产设备，缩短了生产周期，降低了原料成本；4.与国外二步发酵法比较，其发酵规模和产酸量均居领先地位。例子 1983年北京制药厂年产150吨维生素C车间为例，采用二步发酵法新工艺后，

23、每年可节约丙酮297吨（相当于237.8万斤粮食）；节省其他化工原料2600多吨和主要设备58台；降低了原料成本10%。,两者比较,现将1983年的两步发酵法与莱氏法进行同等生产规模的经济指标比较，其优缺点如下：（1）原料消耗 两步发酵法原料总单耗比莱氏法减少31.2%。（2）成本 两步发酵法原料成本比莱氏法降低了233，工厂成本降低了36%。（3）质量 差别不大，在外观、含量、烘烤消光值、分解点、细度等主要控制项目上，两步发酵法略优；但在加速破坏试验中，莱氏法产品稳定性较好。（4）能耗 两步发酵法比莱氏法高出15。（5）总收率（对山梨醇）莱氏法比两步发酵法高出10左右，主要原因是第二步微生物氧化收率仍较低。（6）安全 两步发酵法由于革除了丙酮、苯（或甲苯）、氯气等大量易燃易爆或有毒的化工原料，有利于安全生产。,The end,