第十八章支原体衣原体立克次体.ppt

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1、第十八章支原体、衣原体、立克次体,第一节支原体是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。由于它们能形成有分支的长丝，故称之为支原体。,支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带来一定困难。,一、肺炎支原体,感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统,借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称Pl蛋白。,是青少年急性呼吸道感染的主要病原体，表现为上呼吸道感染综合

2、征，占非细菌性肺炎的13以上。过去认为是温和的病原体，现在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系统的肺外并发症，如心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等。,微生物特性,1形态与结构 类似酒瓶状，没有细胞壁，仅有细胞膜。G-易着色，Giemsa染色呈淡紫色。细胞膜中胆固醇含量多。所有肺炎2株共同具有P1蛋白，是主要特异性免疫原和血清学诊断的主要抗原。,2.抗原结构 来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原，常用生长抑制试验(GIT)与代谢抑制试验(MIT)鉴定。GIT是将吸有型特异性抗血清 的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上，经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现 象。MIT是将支原体接种在含有

3、抗血清培养 基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支 原体不能分解葡萄糖产酸。此两种方法可将 支原体分成若干血清型。,3培养特性 以二分裂繁殖，繁殖较慢；生 长需要胆固醇；反复传代后呈“荷包蛋”状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞。4生化反应 肺炎支原体可根据是否能利用 葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原 体进行鉴别。,5.抵抗力,1.对热的抵抗力一般与细菌相似。耐冷，-70或液氮可长期冻存,4放置也不 要超过3天。2.支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分离出支原体。没有细胞壁青霉素不敏感。,检验程序,1.标本采集 肺炎支原体有粘附细胞作用，以 咽拭子标本为好，取材后宜立即接种。2.PCR法快速、敏

4、感和特异，目前某些临床实 验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中 检测肺炎支原体DNA。3.电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。,4.分离培养,以牛心消化液为基础,加20小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。加入青霉素,可防止杂菌生长。初次分离生长缓慢，在含5C02下培养，10天长出油煎蛋状菌落。能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸与尿素，可还原美蓝。分离培养阳性率不高，对临床诊断意义不大,但对流行病学调查有重要意义。,5抗体检测,(1)ELISA：此法敏感，特异性高，快速、经济，并可检测IgM和IgG抗体，为目前诊断的可靠方法。检测分子量190kDa的P1蛋白，3h可完成试验，特异性高

5、，敏感性为10 4CFUl标本。,(2)补体结合(CF)试验,试验所用的抗原为氯仿甲醇提取的糖脂类抗原。双份血清试验，效价呈4倍增长者，或单份血清效价l：128者，80的病例表明近期有肺炎支原体感染。,(3)间接血凝试验,操作简便，敏感度略高于补体结合试验，感染发病后7天出阳性，10-30天达高峰，12-26周逐渐降低。本试验与补体结合试验类似，主要测lgM 抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反 应。,(4)冷凝集试验,是一种非特异性试验。其方法是将患者血清与O型Rh阴性红细胞在4 下作凝集试验。有3376肺炎支原体感染者为阳性(效价1：64)。效价越高或双份血清呈4倍以上升高，肺炎支原体近期感

6、染的可能性越大。,二、解脲脲原体,也称溶脲脲原体，是1954年Shepard首先从非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道分泌物中分离获得，因其分解尿素的特性命名为解脲脲原体。在分类学上属人支原体科脲原体属。是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，近年来研究发现，它与多种疾病有关，故引起国内外有关学者的广泛重视。,1.寄居泌尿生殖道，传播途径为性接触和母婴传播。致病机制与侵袭性酶有关。吸附后产生磷脂酶分解胞膜中的磷脂，脲酶分解尿素产氨，影响宿主细胞生物合成。产生IgA蛋白酶，破坏IgA的局部抗感染作用，有利于粘附和致病。,2.引起非淋菌性尿道炎(NGU)，上行感染，可引起前列腺炎或附睾炎；阴道炎和宫颈炎

7、，并可导致流产。因为与人精子膜有共同抗原，对精子可造成免疫损伤而致不育。,微生物特性,1形态结构 在液体培养基中以球形为主，直径约50-300nm，单个或呈双排列，能通过微孔滤膜；G-但不易着色，姬姆萨染色呈紫蓝色。无细胞壁，细胞膜由三层膜构成。内、外两层由蛋白质组成，中层为类脂质，胞内含核糖体和双股DNA。DNA中十C含量为269298mol。,2培养特性,营养要求较高，需要供给胆固醇和酵母，常用的基础培养基为牛心消化液。37生长良好，22生长差，42不生长，最适pH为55-65。在含95N2和5C02气体环境下培养2天形成很小菌落，呈“荷包蛋”样，放大200倍才能观察到，故称T株。生长除胆

8、固醇外，尚需尿素，有脲酶能水解尿素产氨，不分解葡萄糖和精氨酸。,3.抗原构造,有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有16个血清型划分为A、B两大群，其中以4型引起疾病频率高。A群各型均含有16kD和17kD多肽；B群各型仅含17kD多肽；而13血清型只含有16kD多肽，以能识别16kD和17kD多肽的单抗，为区别血清群特异性标志。,4抵抗力,由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易被脂类溶媒、清洁剂、酒精、特异性抗体和补体溶解。对热抵抗力差。在4存活约2周左右，70中可存活 2-3年。对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺旋霉素、氯霉

9、素、麦迪霉素、链霉素、丁胺卡那霉素等敏感。,微生物检验,1标本采集 用无菌瓶收集诊断为非淋菌性尿道炎患者中段尿，慢性前列腺炎按摩后的前列腺液，原因不明的不育症患者的精液，阴道炎与宫颈炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等。尿标本以无菌方法取10ml，离心沉渣作接种物。,2标本直接检查,(1)核酸检测16个血清型均有460bp的DNA片段。通过对PCR产物的核酸杂交和序列分析，可将各种支原体鉴别分类。鉴于本法敏感性高、稳定可靠、快速简便，将成为临床快速诊断的重要实验手段。DNA探针技术法敏感，可测出50100pg的DNA。,(2)ELISA 可测定血清型别，还可测出Ig的类型(IgM、IgG)，较敏感

10、、特异性强，有诊断意义。(3)免疫斑点试验(IDT)检测抗原提取物和培养物。此法敏感，特异性，不需特殊仪器，易于推广，可作为临床感染者病原检查的特异诊断方法。,3分离与鉴定,取标本O102ml接种于pH60含有酚红和尿素的液体培养37孵育，颜色由黄变红者为阳性。阳性者转种于固体培养基上，琼脂培养基中有尿素、005molHEPES缓冲液和MgS04，菌落呈黑褐色易辨认，95N25C02或微厌氧环境中作次代培养，以低倍镜观察菌落形态。,经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定。只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸。用特异抗血清作MIT和GIT作进一步鉴定。,三、穿通支原体,能粘附、穿入淋巴细胞和单核吞噬细

11、胞中大量复制，导致宿主细胞受损和死亡。能促进HIV的复制和病程的发展，是艾滋病的辅助致病因素。,为杆状，一端为尖形结构。营养要求高，菌落呈荷包蛋样，生长较慢，初代多在10天以上，发酵葡萄糖，水解精氨酸，但不分解尿素，液体培养基生长时无明显混浊或沉淀。对红霉素、四环素、林可霉素敏感，但对青霉素不敏感。,微生物检验,1标本采集 取材对象是AIDS患者或HIV 感染者。用咽拭子。2选SP-4培养基分离培养，37温箱培养，每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明 无沉淀，视“培养可疑阳性”，再用滤膜过 滤。滤液转种传代，当培养基颜色再度由 红变黄，则认为“初代培养阳性”。,3.鉴定,生化反应(1)培养物接

12、种于含1葡萄糖的SP-4培养基(发酵葡萄糖试验)，若能分解它，培养基 颜色由红变黄。(2)培养物接种于含有精氨殿(不含葡萄糖)的SP-4培养基(水解精氨酸试验)中，若 能水解它，pH上升。(3)培养物接种于仅含尿素的SP-4培养基(分 解尿素试验)中，观察 pH变化。,代谢抑制试验(MIT),取104CFUml阳性培养物分别加入2支含3ml改良的SP-4培养基中，其中1支加入适量抗Mpe标准血清作为试验管，另1支不加抗血清作为对照管，37培养。试验管颜色不变(生长被抑制)，对照管颜色由红变黄(支原体生长)。生长被杭血清抑制的管为MIT阳性，该培养物则为Mpe，根据抗血清的型别进行Mpe分型。,

13、PCR,用Mpe套式PCR(nPCR)，靶基因为Mpe的16SrRNA基因特异性片段。Mpe-nPCR最终扩增长度为410bp，按试剂盒说明书操作，能扩增出特异性MpeDNA，认为此法更灵敏、特异、快速的Mpe检测方法。,抗体检测,国外学者在HIV感染者中用ELISA法检测出大量Mpe抗体，其中无症状者的阳性率为20，有艾滋病者为40，阴性对照0.3。,第二节 衣 原 体,是一类专性细胞内寄生、有独特发育周期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生物。归属于广义的细菌范畴。衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。,一、沙眼衣原体,不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系统感染

14、、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医学界的重视。沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽肿生物变种（LGV）和鼠生物变种等3个生物变种。,1沙眼亚种,(1)沙眼：通过眼-手-眼途径直接或间接密切接触传 播。由A、B、Ba和C血清型引起。结膜引 起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕 及角膜血管翳，影响视力。,(2)包涵体结膜炎：由B、Ba、D、Da等血清型引起。婴儿通过 产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角 膜血管翳。(3)泌尿生殖道感染：由D-K血清型引起。在性接触传播引起的 非淋菌性泌尿生殖道感染（5060）。易发展为持

15、续感染或无症状携带者。,2.性病淋巴肉芽肿亚种，由L血清型引起性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。3.鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠肺炎有关。,微生物特性,1发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发育周期。原体是细胞外存在形式，卵圆形，有胞壁和拟核,是发育成熟的衣原体，具有高度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增大形成网状体；网状体或称始体，圆形，二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，再感染其他细胞，每个发育周期约需4872h。,抗原结构,复杂，有属、种、型等特异性抗原。(1)属特异性抗原：为胞壁LPS，属特异性补

16、 体结合抗原，应用于血清学诊断。(2)种特异性抗原：位于主要外膜蛋白（MOMP）上，可用补体结合试验和中和 试验检测。(3)型特异性抗原：也位于MOMP上，用单 克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼 体的18个型别。,培养特性,沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用68d龄鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养。一般培养4872h后可在细胞内查到包涵体及原体和始体颗粒。近年多采用细胞培养衣原体，常用的细胞株为Hela-299和McCoy。,抵抗力,沙眼衣原体感染材料在37条件下，经48h左右即失去活力，566 min灭活。-70可保存数年，冷冻干燥可保存30年以上仍有活性。O.1甲醛或O.5石炭酸溶液24h杀死

17、沙眼衣原体，2来苏仅需5min。红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣原体有抑制作用。,沙眼和包涵体结膜炎病人，用拭子在结膜上穹窿涂擦或取结膜刮片。性病淋巴肉芽肿：采淋巴结脓汁，也可取直肠拭子或活检材料送检。用光学显微镜观察包涵体有诊断意义，特别在眼结膜、尿道及子宫颈上皮细胞内发现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考。,免疫学方法,1)免疫荧光检查：用荧光抗体检测上皮细胞内衣原体抗原。标记抗衣原体LPS抗体，可与所有衣原体反应；而抗MOMP抗体有种、型特异性。可在1h内即作出诊断并可分型。2)酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本。,核酸检测,1)核酸杂交：用12

18、5I标记的衣原体rDNA探针检测宫颈标本的敏感性和特异性，与培养相比分别为82.8和99.4。2)PCR：具有高度敏感性和特异性。一般按沙眼衣原体75kb质粒、MOMP序列及16SrRNA基因序列设计引物。,分离培养,将标本拭子，用含抗生素的稀释液制成10-20悬液。分离的细胞有McCoy、HeLa-229细胞等。置5CO2下培养。初代分离培养72-96h后传代或盲传。有症状病人90标本第1代即可见包涵体，而无症状病人需传代后才得到阳性。敏感性为80-90，特异性100，是目前确诊最可靠的方法，而且是评价实验室诊断法的标准。,鸡胚培养,有细菌污染的临床标本加适当的抗生素(如链霉素、庆大霉素和制

19、霉菌素等)肉汤，在室温中作用lh后，接种3-4只孵育7天的鸡胚卵黄囊，35孵育，观察至13天，收获卵黄囊涂片，作Gimenez染色，镜检原体。,鉴定,1.将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检胞质内包涵体。Giemsa染色比碘染色敏感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。2.可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原。,抗体检测,目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价值很小。原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，因而限制了血清学方法的诊断价值。方法有补体结合试验(CF)、微量免疫荧光试验(MIF)

20、、酶免疫法等。其中CF敏感性和特异性较差，而MIF敏感性和特异性较高。,三、鹦鹉热衣原体,鹦鹉热衣原体是鹦鹉热的病原体，主要引起禽畜感染，也可由动物传染到人，引起肺炎和毒血症，亦有引起心内膜炎的报道。也有衣原体独特的生活周期，包涵体较致密，形态不一，碘染色阴性，是与沙眼衣原体鉴别要点(沙眼衣原体含糖原，碘染色阳性)。,抗原检测,1)免疫荧光检查：以衣原体属、种或型的单克隆抗体与荧光素结合后中衣原体抗原的存在，用微量免疫荧光法还可用于衣原体的分型。2)酶免疫法(EIA)检测：将衣原体单克隆抗体与酶结合，用于组织或细胞的染色，枪测衣原体抗原。E1A法比免疫荧光法准确性略高，且可避免主观因素的影响。

21、,核酸检测,1)核酸探针检测法：将衣原体MOMP基因、特异LPS表位基因，及其他决定鹦鹉热衣原体抗原的基因片段做成探针，对衣原体DNA进行斑点杂交或Southern印迹杂交试验，可准确灵敏测出鹦鹉热衣原体，也可用于种内株系的鉴别。2)PCR：检测3种衣原体的MOMP基因序列是简便、微量、快速、敏感的检测力法。,分离培养,(1)鸡胚培养：鹦鹉热衣原体的分离常用鸡胚卵 黄囊接种与传代，可取得满意效果。(2)小鼠分离：选择腹腔接种、颅内接种和滴鼻 接种进行试验。最具特征性的发现小鼠嗜眠 和麻痹，胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘 性渗出物，全肺叶有实变。,(3)细胞培养：细胞培养常用PL细胞、BHK细

22、胞、Vero细胞等，鹦鹉热衣原体均能生长。但直接用于临床标本的分离培养效果不好，最好先接种鸡胚卵黄囊，经繁殖后再细胞培 养容易成功。,抗体检测,方法有补体结合试验(CF)、间接血凝试验(IHA)和酶联免疫吸附试(ELISA)等。补体结合试验：主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉芽肿以及肺炎的试验。CF抗体效价呈4倍增长者可作诊断。一次CF抗体结果，需效价高于1：64才可能作临床诊断。,四、肺炎衣原体,肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种，只有一个血清型，是一种重要的呼吸道病原体。主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等。还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。肺炎衣原体性感染与急性心肌梗

23、死和慢性冠心病的关系，越来越引起人们的注意。,微生物特性,1有衣原体独特的生活周期，原体在电镜下呈 型的梨形，并有清晰的周浆间隙。2全基因组测序已完成，与鹦鹉热衣原体、沙 眼衣原体的DNA同源性10，而不同来 擗TWAR株都具有94以上的DNA同源性，其限制性内切酶的图谱相同。其单克隆抗体 与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应。3用HEp-2和HL细胞系较易分离和传代。,抗体检测,以微量免疫荧光试验(MIF)最为敏感，该试验阳性者5070可分离出 TWAR，用此法检测特异性的IgM和IgG抗体，有利于区别近期感染和既往感染，也有利于区别原发感染和再感染，TWAR的再感染相当常见，特别是老年人，

24、再感染时一般不出现lgM和补体结合抗体。,第三节 立克次体,对人致病的立克次体有五个属立克次体属、柯克斯体属、东方体属、埃立克体属和巴通体属。,共同特点,大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病；以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性，主要为微，杆状或球杆状，革兰阴性；除了少数外全是专性活细胞内寄生；菌体内同时含有DNA和 RNA两类核酸；以二分裂方式进行繁殖；对抗生素敏感。,一、斑疹伤寒立克次体,(一)临床意义 1普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传 斑疹伤寒)的病原体。病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介，而非储存宿主。传播方式为虱-人-虱，体

25、虱仅是传染媒介。,莫氏立克次体,地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒)的病原体。啮齿类动物是主宿主，传播媒介是鼠蚤或鼠虱。鼠蚤叮咬人体时，常排粪于皮肤上，斑疹伤寒立克次体从抓破的伤口进入人体。若有人虱寄生，可通过人虱为传播媒介，继发性地在人群中传播。,致病物质,有两种，其一是内毒素，主要成分为脂多糖(LPS)；其二为磷脂酶A,能损伤宿主细胞膜及溶解胞内吞噬体膜，以利于病原体穿入宿主细胞并在其中生长。普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相似，以高热、头痛、全身皮疹为主要特征。伴有神经系统、心血管系统等症状和实质性器官损伤。,(二)微生物特性,1.比细菌小，呈多形态性，在感染细胞内聚 集成团,分布在胞

26、质内,Gimenez法染色后 呈红色，外表含有微荚膜结构。2.必须在真核细胞内才能生长繁殖，培养时 需要C02。通常采用5-9日龄鸡胚作卵黄囊接种，于32-35孵育413d内死亡，鸡胚死亡时间与接种剂量大小呈直接相关。普氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长繁殖。豚鼠可作立克次体的初代分离。,3.有群特异性和种特异性两种抗原。大部分立克次体与普通变形杆菌X菌株的菌体耐热多糖抗原有共同的抗原性，故可用这些菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检测抗体，这种交叉凝集试验被称为外斐反应，可供辅助诊断。,外斐反应,(三)微生物检验,1.标本采集(1)病人血液标本：发热期均有立克次体血症，在急性期较易检出立

27、克次体。争取在用抗生 素前采血，立即床侧接种。(2)活检或尸检材料：肺、肝、脾、淋巴结、心 瓣膜等标本。,2.标本直接检查,(1)免疫荧光检测 用于脏器检查。制备标本片薄而均匀，组织结构清晰，固定后用荧光抗体染色,常见脾、肺及心瓣膜中有立克次体，也可在肝、肾及皮疹活检组织中检出。(2)核酸检测 PCR敏感性高，所需样品量只需ELISA实验的15。以编码17kD蛋白的基因和编码普氏和莫氏立克次体169kD蛋白的基因作为扩增靶区。,引物R17-1、-2在65条件下能扩增普氏和莫氏立克次体DNA。在琼脂凝胶上产生一条340bp的核酸带；引物R169-1、-2仅能扩增普氏立克次体DNA，产生一条432

28、bp的核酸带。两种引物同时使用，扩增后普氏可产生340bp和432bp两条带，而莫氏只产生340bp一条带。该法敏感性可达005ngDNA水平，重复性好，操作方便，对两型立克次体早期、鉴别诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价值。,3分离培养,(1)动物接种 选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现象。每日测体温，至40发热时采血或脏器悬液、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立克次体；感染莫氏立克次体豚鼠在发热12日内出现阴囊红肿，解剖可见腹股沟淋巴结肿大、充血、脾大2-3倍，有腹水；有阴囊反应者，睾丸有小出血点，鞘膜充血并有浆液性渗出物等。鞘膜涂片可查到立克次体。,(2)鉴定,用免疫荧光法鉴定感染

29、动物脏器、鸡胚卵黄囊、细胞培养物中的特异性抗原以已知抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体。必要时用补体结合试验、微量凝集试验等，作群和种的鉴定。,(3)分离株繁殖及保存,鸡胚卵黄囊培养 收获卵黄囊，经涂片染色镜检,含立克次体较多而又未发现细菌的卵黄囊膜，或将其作成适当浓度的悬液置-70冰箱保存，或冰冻干燥保藏；细胞培养：选鸡胚、成纤维、人羊膜、HeLa等细胞，接种培养、鉴定后将立克次体大量繁殖的感染细胞置-70储存。,4抗体检测,立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐反应、间接免疫荧光(IFA)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)外，还有补体结合(CF)试验、微量凝集(MA)试验、间接血凝(IHA

30、)试验、胶乳凝集(LA)试验等。,(1)外斐反应,除Q热、立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性外，其他为阳性。患者OX凝集素上升较晚，在病程2周左右方出现阳性，病程中双份血清试验，若效价有4倍增长，方有诊断意义。,有些病例在病程中效价不见上升，约15的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例。有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者，其他血清学试验阳性，但外斐反应可为阴性。斑点热病人外斐反应效价通常为OX19高于OX2，但也有OX2较高者。若仅出现OX2阳性，则对诊断斑点热有特殊意义。,(2)IFA试验,为现在诊断立克次体病常用的方法。用已知立克次体抗原(感染鸡胚卵黄囊或细胞培养悬液)制片，以低稀释度的病人血清初筛

31、，有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者，判为阳性。再将病程早期及晚期血清分别作双倍或4倍稀释以测效价，如呈48倍增长者可明确诊断。,(3)ELISA,检测IgM抗体对早期诊断有价值。立克次体抗原吸附于载体。泛影葡胺梯度离心纯化抗原为优，检出血清的抗体效价高，纸上ELISA测定抗体，方法简便。将感染卵黄囊悬液加于玻片(经氯仿甲醇洗净)上，凉干、固定，加稀释血清于抗原点上，每张玻片上包括阳性和阴性对照，加酶标兔抗人IgM/G于抗原血清点作用后，将浸透新鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约4-6min，可见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色，取下滤纸条(即终止反应)，观察是否显色，与对照比较判定结果。此法

32、简便，并可保存实验记录。,(4)CF试验,CF试验原来是立克次体病血清学诊断的经典试验，虽然敏感性不如IFA和 ELISA，但非常特异。一般在立克次体病发病一周内，血清中即有CF抗体出现，以后逐渐上升，至第3周达最高峰，然后逐渐降至较低的效价，并可保持几年不消失，但也有在病后几周即转阴性者。病人恢复期血清与斑疹伤寒群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳性结果，只能说明该群立克次体的感染。,三、恙虫病立克次体,又名东方立克次体是恙虫病的病原体，由恙螨叮咬侵入人体，对人体致病性很强，释放的毒素样物质是主要致病因素，引起发热皮疹全身中毒症状，以及全身淋巴结肿大及各组织器官的血管炎病变。虫咬处溃疡形成

33、黑色焦痂，周围有红晕等为其特征。为自然疫源性疾病。,(一)微生物特性,1具有多形性，但以短杆状为常见。G-,姬姆 萨染色呈紫红色,Gimenez染色呈暗红色，背景为绿色。可以鉴别恙虫病立克次体和 其他立克次体。分布在细胞质内，密集于 细胞核旁。细胞内寄生。,2培养特性,(1)动物接种：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘液涂片检查，可见细胞质内有大量立克次体，尤以腹膜上皮细胞内多见，常密集于细胞核旁。,(2)细胞培养：恙虫病立克次体可以在多种细胞内生长、繁殖，多采用Vero、L929细胞进行培养。细胞感染需要适宜的温度和吸附时间，通常以37吸附1h，培养32为宜，繁殖缓慢，用Vero细胞培养89d，在细

34、胞质内生长繁殖，在细胞核旁高度密集，但不侵入细胞核。,3抗原成分,恙虫病立克次体具有耐热性多糖抗原和特异性抗原。恙虫病立克次体和变形杆菌OXk株有共同的抗原成分，在Weil-Felex反应中，血清与OX，抗原发生凝集而不与OX19、OX2发生凝集。,(二)微生物检验,(1)抗原检测：ELISA间接法是检测标本的特异性抗原或抗体的最常用方法。(2)PCR：可检出20ng恙虫病立克次体DNA；套式PCR法可检出200pg，是目前最为快速、特异、敏感的实验室诊断方法，可用于急性期患者的早期诊断。依据56KD蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因序列选择引物，进行目的 DNA 扩增，然后用15琼脂糖电泳法

35、检出特异性DNA带。,(3)分离培养,接种小鼠分离病原。将标本接种腹腔O5ml，一般多在718天死亡，感染小鼠有明显症状，濒死前解剖，可见皮下淋巴结肿大充血，脾肿大，有粘稠的腹腔渗出液，以Giemsa染色镜检，在靠近细胞核旁边可见成堆排列的立克次体。也可接种Vero细胞、L929细胞进行立克次体分离培养。细胞培养1015天，取细胞涂片，Giemsa染色镜检。,(4)抗体检测,外斐试验：临床血清学诊断方法，血清抗体OXk效价达l：160以上有意义，病程中双份或多份血清试验，若效价有4倍增高，有诊断意义。由于外斐试验特异性、敏感性低，容易造成误诊或漏诊，不应作为恙虫病的诊断方法。,免疫荧光试验：快

36、速敏感特异，可分别检测患者血清中的抗恙虫病立克次体lgG、IgM抗体，效价在1：80以上有诊断意义。双份血清有4倍或以上增长可以确诊。,四、贝纳柯克斯体,又称Q热立克次体，是引起Q热(疑问热，指最初不明病因的发热)的病原体。传染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱为传播媒介，对人感染力特别强，通过接触、呼吸道、消化道等途径使人及动物发生感染。Q热除有发热、头痛及肌肉痛外，以出现肺炎和肝炎为其临床特征。慢性Q热主要表现为心内膜炎。,（一）微生物特性,1.形态与结构 个体较小，多为短杆状，常排列成对，Gimenez法染色呈红色，背景呈绿色，用Giemsa法染色呈紫红色。有荚膜，在鸡胚卵黄囊或细胞培养内

37、均可有芽胞形成。2.基因组与抗原成分 基因组分子量为大肠杆菌的13；编码代谢酶、表面抗原与毒力因子有关基因。有两相抗原，相为光滑型LPS，相为粗糙型短链LPS。,3培养特点,鸡胚是培养的极好宿主。一般经培养1012d，1g卵黄囊膜常可获得约1000g纯净的立克次体能在多种人和动物的原代或传代细胞内繁殖。一般不引起明显的细胞病变。,4抵抗力,贝纳柯克斯体抵抗力强，70-90加热3060min尚难杀死。1%福尔马林作用24小时也不能完全灭活。对氯霉素和四环素类抗生素敏感。,(二)微生物检验,(1)标本直接抗原检测：免疫荧光法进行检测。(2)标本直接核酸检查：按16SrRNA非保守区序列合成寡核苷酸

38、探针，能检出5pgrRNA，如将非保守区特异性扩增，其敏感性可达检出110个贝纳柯克斯体的水平。用贝纳柯克斯休质粒DNA片段制备的探针，不仅能快速检出病原体，且能鉴别含QpHI或QpRS质粒分离株，与呼吸道感染病原体DNA无交叉反应。试验仅需812h即可得到结果。,3分离培养,病原体分离只是在该地区尚未证明有Q热存在，病情特别严重有必要。将标本接种于豚鼠或培养细胞，观察其发病与否或生长情况，经形态学、血清免疫学等鉴定后作出结论。,4抗体检测,用间接免疫荧光试验、ELISA和CF试验。CF试验中抗原相的选择对结果影响极大，对现症诊断主要看相抗体逐渐上升，若相抗体保持较高水平，则往往说明慢性感染或

39、隐性感染。,五、埃立克体,(一)临床意义为埃立克体病病原体。1.人腺热埃立克体病 可能由蜱传播，也 可能由于摄食生鱼引起。临床表现为发 热头痛、淋巴细胞数增加，并出现非典 型淋巴细胞。2.人单核细胞埃立克体(HME)病，主要侵 染人的单核细胞和巨噬细胞。传播媒介 为蜱。,3人粒细胞埃立克体(HGE)病 主要侵犯人 粒细胞。硬蜱是传播媒介。也是莱姆病 病原体的携带和传播者，故与莱姆病的 相重叠。,（二）微生物特性,1为G-小球菌，呈多形性，Romanows染 色呈兰色和紫色。吞噬细胞以内吞的方 式将埃立克体摄入胞内，在胞质内以二 分裂的方式繁殖，形成包涵体。称为桑 椹体。,2基因组 埃立克体的1

40、6SrRNA基因极保守，但5端的50100碱基为高变区，适合设计 PCR引物或核酸杂交探针。人粒细胞埃立 克体的外膜蛋白44kDa蛋白被克隆，可用 作探针。3抗原成分 在埃立克体属内的各种埃立克 体均可有血清学交叉反应。,(三)微生物检验,1.标本直接显微镜检查 采集病人的外周血制备血片，经Giemsa或Wright染色，在光镜下发现粒细胞及单核细胞质或血小板内有圆形、深紫色的桑椹体，可作为急性期埃立克体病的一种简便和有效的辅助诊断方法。,2.核酸检测,PCR是最有效的埃立克体病的病原学诊断方法，可用于埃立克体病的早期诊断。大约80-87HME和43-75的HGE患者的血标本被PCR检测为阳性

41、。特异性几乎为100，主要依赖引物的特异性。可用16SrRNA基因设计引物或做基因探针。有极高的敏感性，感染后数天就可检出阳性结果。,3.细胞培养,查菲埃立克体可用犬巨噬细胞系(DH82)，腺热埃立克体用小鼠的巨噬细胞系(P388D1)，人粒细胞埃立克体则用人的粒细胞白血病细胞系(HL-60)作它们的体外培养的宿主细胞。将3ml抗凝血的白细胞层，接种细胞单层，置 37的5C02孵育箱中培养，每隔3-4天换一次细胞维持液，并刮少许细胞涂片，用Giemsa染色，在光镜下检查埃立克体包涵体。,4.小鼠接种,从蜱体内分离埃立克体让蜱叮咬小鼠和吸血。或将病人或动物的抗凝血的白细胞注入小鼠腹腔。观察小鼠发

42、病。定时采小鼠血作涂片染色、IFA、PCR等证明小鼠被埃立克体感染，用腹腔液涂片染色镜检包涵体。,5.抗体检测,(1)间接免疫荧光(1FA)：将感染血清作倍比稀释，加入抗原孔内，置湿盒37孵育lh；玻片冲洗后，用 Evans蓝作背景染色，然后每孔加一滴固 定液，加盖玻片，在荧光显微镜下检查感 染细胞内的带荧光的包涵体，通常血清中 抗体滴度 1：20为阳性。若获双份血清效 价增高4倍以上即可明确诊断。,(2)免疫印迹 采用免疫印迹检测埃立克体病患者血清 中抗埃立克体主要抗原组分的抗体，可 以改善血清学检测的特异性。经免疫印 迹分析发现HME患者血清中含有抗查菲 埃立克体的44kDa抗原组分的Ig

43、G抗体。但不能用于埃立克体病的早期诊断。,六、汉赛巴通体,引起杆菌性血管瘤杆菌性紫癜(BAP)和猫抓病(CSD)的病原体。常在免疫缺陷病毒(HIV)感染者发生，也感染有免疫潜能的人群，与接触猫有关。为G-营养要求苛刻的需氧杆菌，为兼性胞内寄生菌。,猫抓病有与猫接触史，抓咬部位形成丘疹脓疱，继而出现淋巴结肿大，约10病例有肉芽肿性结膜炎、骨质溶解、肺炎及中枢神经系统损害等。,杆菌性血管瘤-杆菌性紫癜,常在免疫低下者发生。与猫抓伤咬伤有关，主要表现为皮肤损害和内脏发生紫癜。在病变处能发现杆菌状小体。开始皮肤出现红丘疹，偶有溃疡。皮下出现肉色结节。杆菌性血管瘤可发生在任何实质性器官，很难与分枝杆菌和

44、真菌感染或恶性肿瘤鉴别。,(一)微生物特性,1为G-弯曲的杆状小体，常呈多形性；初 分离有菌毛，发现有噬菌体。2培养特性 营养要求苛刻的需氧杆菌，用 含新鲜血的琼脂或脑心浸液于355 C02环境下培养25周才长出灰色凸起 并嵌入琼脂内的菌落。,3基因组 约为2005kb。已经测序的基因 有16SrRNA和 glt A基因序列包括1293 核苷酸，始于ATG起始密码子，终于 两TAA终止密码子。,(二)微生物检验,1.标本染色直接检查 活检病理标本和淋巴结活检用Warthin-Starry染色能查见多形性菌体。2.核酸检测 依16S rRNA或gltA基因设计引物，对临床标 本作 PCR，其扩增产物经序列测定或用特异 性DNA探针鉴定，可直接作出病原诊断。,3.分离培养,可将血液标本先经溶血和离心处理，待长出菌落后作生化反应，分析其细胞脂肪酸和16SrRNA序列等加以鉴定。于培养1周仍不见生长，应继续培养至4周。,4.抗体检测,(1)IFA：双份血清滴度呈4倍增长为阳性；单份 血清滴度至少达1：64方可考虑诊断。(2)ELISA：用 17KD重组体抗原作 ELISA检测 人血清抗体IgG，有助于诊断。(3)免疫印迹试验：可显示 485kDa 蛋白质组 分，而非巴通体感染病人血清则不能与此蛋 白组分反应，以此作为确证试验。,