限制性内切酶的应用.ppt

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1、限制性内切酶的应用,病毒免疫室,限制性内切酶的发现,30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司寻找更多的限制性内切酶,限制性内切酶的特点,限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cj

2、e I更大 除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现 在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。,限制性内切酶的主要功能,保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。,限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶（甲基化酶）出现。后者的作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶

3、破坏 限制性内切酶和它的搭档-甲基化酶一起就构成了限制-修饰（R-M）系统。在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行,限制性内切酶的命名,限制性内切酶命名的次序如下：A）用3个字母代表来源的生物（如Bam代表 Bacillus amyloliquefaciens）B）1个字母或阿拉伯数字代表菌株（BamH）C）1个罗马字母代表发现或鉴定的次序（BamHI）,限制性内切酶的分类,按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类 I型限制性内切酶是一类兼

4、有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确定的限制片段和明确的电泳条带，因而不具备实用性。,限制性内切酶的分类,II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。,限制性内切酶

5、的分类,III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生确定的切割片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。,II型限制性内切酶的分类（一）,内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I识别GCCNNNNNGGC）。限

6、制性内切酶的切割后产生一个3羟基端和一个5磷酸基团。它们的活性要求镁离子的存在，而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右。,II型限制性内切酶的分类（二）,IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。,II型限制性内切酶的分

7、类（三）,第三种II型限制性内切酶（有时也被称为IV型限制性内切酶）是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列（如Bcg I：CGANNNNNNTGC），并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端有一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性

8、内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。,一些概念,粘末端和平末端同尾酶同裂酶同识异切酶消化星号活力,同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是5CCGG3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。,同裂酶和同尾酶：,有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如Xb

9、a(TCTAGA)、Nhe(GCTAGC）、Spe(ACTAGT)切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即 Bfa（CTAG)的酶切位点。,同尾酶：,限制性内切酶的应用,克隆（有时与甲基化酶联用）鉴定（基因片断大小、正反向）检测突变（识别位点，限制酶切图谱的多态性）制作Marker,单酶切与双酶切的选择策略,运用载体的限制载体的自身环化（挑选阳性克隆的工作量）克隆的方向（鉴定）,质粒,该实验用质粒pCMV-Myc-T10经EcoR单酶切后应为5.7kb；用EcoR和Xho双酶切后应产生两条DNA

10、片段，一条是3.8kb，另一条是1.9kb（如下图）。,3.0,6.0,EcoRI,EcoRI&XhoI,DNA Marker,2.0,3.8,1.9,5.7,限制性片段长度多态性 RFLPs(restriction fragment length polymorphisms),1987年，第一张较完整的人基因连锁图，500多个RELP 位点，定位了Huntington病，CF（囊性纤维化）和癌相关基因（APC，DCC 等）,RFLP在遗传病检测中的应用,镰状细胞贫血症（globin，6），其GAGGTG的突变，可用RFLP（Mst II，CCTNAGG）或PCR-SSCP检出。,甲型血友病（

11、FVIII，XR）可用PCR-RFLP检出。,142 bp 99 bp,引起镰刀型红细胞贫血症的原因就是基因的点突变，即编码血红蛋白肽链上一个决定谷氨酸的密码子GAA变成了GUA，使得肽链上的谷氨酸变成了缬氨酸，引起血红蛋白的结构和功能发生了根本的改变。肽链基因上单个核苷酸的替换AU恰好使该基本片段丢失了可被Mst II或Cvn切开的一个限制性内切酶位点。由于基因突变改变了限制性酶切的结果，用Southern blot分析方法和限制性片段长度多态性（简称RFLP）分析方法即可对镰刀型红细胞贫血症胎儿做产前诊断，或对发病家族成员的基因组型进行分析。,0.5 g的1kb DNA Ladder 0.

12、8%TAE琼脂糖凝胶，EB染色,数据库,限制性内切酶的数据库 其中含有已知的所有限制性内切酶的完整表，包括识别的序列，甲基化的敏感性，商业信息和参考文献。,应用中的注意点,1、建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1g不同来源和纯度的DNA。通常，一个50l的反应体系中，1l的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1g已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1ug lambda

13、DNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。,2、选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接,3、加酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的

14、其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。,4、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素,5、缓冲液 对于每一种酶都提供相应的最佳缓冲液，可保证酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100g/ml的BSA以实现最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响,6、反应体积 内切酶活力单位的定义是：1小时内，50l反应体积中，降解1g的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为

15、了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）,7、混合 这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！,8、反应温度 大部分酶的反应温度为37；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65不等,9、反应时间 1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全,10、终止反应 如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使

16、用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10l/50l反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65或85，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。,11、贮存 大部分酶应贮存于-20。少部分酶则须在-70长期保存。10X BUFFER 和100X BSA于-20保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀,12、稳定性 每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20条件下十分稳定。高于-20条

17、件下稳定性将有所降低,13、对照反应 如果发现DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开,使用限制性内切酶的一般步骤,A）测试酶切DNA的量B）计算完

18、全酶切所需的酶量。为使终体积中甘油的浓度低于8%，计算能加的酶量，最多能加终体积的10%（甘油的浓度为5%）。C）10X反应液的体积应为终体积的1/10；10X反应液的体积不应小于酶的体积。D）加入计算好的DNA，10X反应液，酶。加入水到终体积（20-50 ul），轻轻混匀，在适当的温度下保温。一般酶的最适温度为37 oC，但有例外。应查讯分析说明。,举例,质粒DNA（2ug/ul）5 ul10X反应液 5 ul酶（5ug/ul）5 uldH2O 35 ul总体积 50 ul37 oC保温2-3小时。应最后加酶。,应用中的疑问,1、一次使用两个限制性内切酶的一般步骤是什么（比如双酶切）？其步骤如同使用一个限制性内切酶的一般步骤。但要注意两个限制性内切酶在同一种缓冲液中都要有活力，即：使用通用缓冲液。谷氨酸钾缓冲液适用所有的酶切。,2、能否在一次反应中用很多的限制性内切酶？可以，一般而言，甘油浓度超过8%对酶切有抑制。有些酶在高的甘油浓度中会产生星号活力。限制性内切酶提供在50%的甘油中，故10 ul反应体积中不应加入超过1.6 ul的酶。,