转基因与动物克隆.ppt

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1、转基因与动物克隆的概况与进展,许晓风（南京师范大学生命科学学院）,转基因概况 转基因进展动物克隆概况动物克隆进展,主 要 内 容,转基因与动物克隆,人工转基因：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，使之稳定遗传与表达，同义词有“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”等。经转基因技术修饰的生物体常被称为“遗传修饰过的生物体”（Genetically modified organism，简称GMO）。自然转基因：自然界自发的基因在不同动物或植物间的转移现象。转基因植物：含有并能稳定遗传和表达外源基因的植物。转基因动物：含有并能稳定遗传和表达外源基因的动物。动物克隆：“clone”源于希腊语

2、的“kln”（嫩枝）。通常是指以人工诱导或自然发生的无性生殖方式产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。动物克隆即是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术，即通过核移植生产遗传结构与细胞核供体动物相同的动物个体的过程。,4,1971年史密斯等人从细菌中分离出一种能切开病毒DNA分子的限制性内切酶，标志着DNA重组时代的开始；1972年伯格等用限制性内切酶分别酶切猿猴病毒DNA和噬菌体DNA，并将二者用连接酶连接起来，得到重组DNA分子；1973年科恩等进一步将酶切的DNA分子与质粒DNA连接起来，获得重组质粒并转入大肠杆菌中；1978年全球第一个重组DNA技术公司Genetech开始利用重组大

3、肠杆菌生产人胰岛素。1980年第一例转基因动物转基因小鼠在美国成功培育1982年第一例转基因植物转基因烟草在美国问世1987年第一例转基因微生物防冻基因工程菌进入田间试验1994年第一例转基因作物延熟保鲜番茄在美国上市,转基因技术发展简史,5,1983年，华盛顿大学 Chilton等培育出抗卡那霉素的转基因野生烟草；比利时的Jeff Schell等培育出抗卡那霉素和氨甲喋呤的转基因烟草；孟山都的Robert Fraley等培育出抗卡那霉素的转基因矮牵牛花；威斯康辛的John Kemp 等将一大豆基因转入向日葵中。1990年，首例转基因酵母食品在英国被批准上市；90年代初，由加利福尼亚Calge

4、ne公司研制的FlavrSavr转基因番茄上市。,The Washington University group,headed by Mary-Dell Chilton,had produced cells ofNicotiana plumbaginifolia,a close relative of ordinary tobacco,that were resistant to the antibiotic kanamycin(Framond et al.,1983).Jeff Schell and Marc Van Montagu,working in Belgium,had produc

5、ed tobacco plants that were resistant to kanamycin and to methotrexate(氨甲蝶呤),a drug used to treat cancer and rheumatoid arthritis(Schell et al.,1983).Robert Fraley,Stephen Rogers,and Robert Horsch at Monsanto had produced petunia plants（矮牵牛花）that were resistant to kanamycin(Fraley et al,1983a).The W

6、isconsin group,headed by John Kemp and Timothy Hall,had inserted a bean gene into a sunflower plant.,转基因植物发展简史,Calgene,Inc.,a biotechnology company with headquarters in Davis,California,has developed a tomato with a gene that slows the natural softening process that accompanies ripening.The company

7、says that their Flavr Savr tomato spends more days on the vine than other tomatoes,resulting in more flavor,yet remains firm enough to be shipped.Calgenes scientists isolated the PG（polygalacturonase,聚半乳糖醛酸酶）gene in tomato plants.The next step was to convert the tomato PG gene into a reverse image o

8、f itself called an antisense orientation.The scientists called this“reversed”tomato gene the Flavr Savr gene and reintroduced it into the plants.,转基因番茄Flavr Savr的研制,Calgene公司培育延熟保鲜番茄过程：1）从番茄植株中分离聚半乳糖醛酸酶基因PG；2）将PG基因转变成反义拷贝、称之为Flavr Savr 基因；3）将Flavr Savr基因重新导入番茄植株体内；,In order to tell if the Flavr Savr

9、 gene was successfully reintroduced into the plants,Calgene scientists attached a gene that makes a naturally occurring protein that renders plants resistant to the antibiotic kanamycin.By exposing the plants to the antibiotic,Calgene scientists could tell which plants had accepted the Flavr Savr ge

10、ne.The ones unaffected by kanamycin grow to have the desired traits of the Flavr Savr.,转基因番茄Flavr Savr的研制,4）为了检验FS基因是否成功导入进植株，科学家在FS基因后面附加了一个抗卡那霉素的基因，然后将受体植株暴露于卡那霉素中，不受卡那霉素影响的受体植株同时也是整合了SF基因的植株。,转基因番茄从研制到商品化全过程示意图,9,First biotech plant product Flavr Savr tomato,转基因植物产品与对照产品,转基因抗虫棉和普通棉对照,转基因耐贮藏番茄（左）和

11、普通番茄（右）,转基因技术与传统技术,12,Traditional crossbreeding,Recombinant DNA techniques,转基因技术的发展全球概况,农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）执行纲要简报,1996-2005年，生物技术作物全球累计种植面积为4.75 亿公顷，10 年间累计的全球市场价值约为293 亿美元。,14,自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。,国际农业生物技术应用服务局（ISAAA）统计结果,转基因技术的发展现状,15,转基因产品销售情况：2010年转基因产品年销售额

12、达到200亿美元，1500万农民种植转基因作物。转基因作物种植国家情况：美国（59%），阿根廷（20%），加拿大（6%）中国（5%），欧洲很少美国最早批准种植转基因作物2004年3月英国批准大面积种植转基因作物，但要求非常严格。2005年德国通过法案，严格限制（包括实验室研究）。,16,美国：3900万公顷 加拿大：350万公顷 阿根廷：1350万公顷 中国：210万公顷,17,转基因作物种类：大豆、玉米、棉花和油菜等，大豆面积最大。,目标性状：抗除草剂大豆、玉米和棉花占转基因作物74%。抗虫和抗病毒病：Bt玉米、Bt棉花占19%。耐除草剂+抗虫性双价的转基因棉花和玉米占7%。,18,我国转基

13、因作物研究与利用概况 我国是世界上商品化种植转基因作物最早的国家之一。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性能达到60，产量比对照增加15，产值增加20，1992年每亩增收200元，现已退出应用。,至1999年我国已批准中试的转基因作物有48项：包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等11种作物；主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。已批准环境释放的有49个品种，涉及水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种作物。,转基因操作流程示意图,基因工程示意图,植物转基因技术示意图,21,转基因育种的程序,基因分离,体外重组,

14、转化,转化体,安全性评价,结合常规育种,转基因品种,遗传稳定性评价,市场开发,载体的构建,农杆菌介导基因枪轰击,筛选,22,(一)目的基因的获得 根据获得基因的途径分为两大类：根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆；从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。,1.根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆 主要步骤如下：利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。局限性：兼并密码子、效率低、未知基因及产物。,分离蛋白质,明确氨基酸序列,推导核苷酸序列,人工合成,23,2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因,(1)同源序列法(Homology Based Cand

15、idate Gene Method)根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。,氨基酸序列比较,设计简并引物,PCR扩增,文库筛选/RACE,24,（2）表达序列标签EST：EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过cDNA的途径获得。,mRNA,cDNA,反转录酶,cDNA文库,PCR,差异显示,抑制消减杂交,EST,RACE/文库筛选,dbEST,GenBank,25,（3）根据连锁图谱克隆目的基因的图位克隆技术,26,(4)转座子标签法：转座子是一段可复制、移动的 DNA片段。当转

16、座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。目前应用最为广泛的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。,插入突变体,筛选突变DNA文库,鉴定性状遗传分析,转座子DNA探针,基因部分DNA探针,筛选野生型DNA文库,完整目的基因,互补实验,27,(5)差异显示法 在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式，叫做基因的差异表达。差异显示PCR(DD-PCR)是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。

17、,叶mRNA,根mRNA,反转录,反转录,PCR,随机引物+3 锚定poly(t)引物,PCR,PAGE,叶,根,28,(6)cDNA微阵列,cDNA 芯片：cDNA序列（纯样）机器点样在支持物，与荧光标记的不同mRNA样品分别进行杂交，通过激光共聚焦扫描分析不同cDNA序列的杂交信号强度，判断该cDNA在不同mRNA样品中的表达丰度。,mRNA 1,mRNA 2,29,（二）目的基因重组质粒的构建,目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中包括保存用中间载体（大肠杆菌寄主）：pBR322、pUC、pBluescript K、pKS,pGEM-T 繁殖载体（大肠杆菌寄主）：JM109,TOP10

18、植物转化载体（农杆菌寄主）：pBI121,pCAM1001,30,分离基因,克隆到某中间载体,转化大肠杆菌,提取质粒,限制酶切/连接,克隆到植物表达载体,转化农杆菌,基因枪转化,pKS,pBR332,pGEM-T,JM109,TOP10,HindIII/EcroI T4 ligase,pBI121,pCAM1001,LBA4404、EHA,31,农杆菌:used extensively for genetic engineering of plants.包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid(bacterial plasmid)T-DNA(Transferred-DNA),

19、可以转移进入植物基因组。,Tumor induced byA.tumefaciens,32,Ti Plasmid,T-DNA region,Left border,Right border,vir genes,ori,已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。,auxin,33,Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，约有200kb组成。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆

20、菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine),Ti质粒的遗传特性及类型,34,Ti质粒的功能区域,（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）：农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（virulence region）该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。（3）Con区（regions encoding conjugations）该区段上存在着与

21、细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（origin of replication）该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。,35,野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：Ti质粒分子量过大，一般在160240kb，比pBR322质粒大50倍左右；大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因；T-DNA区内含有许多编码基因，其中Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细

22、胞的分化和植株的再生；Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,其重组质粒也只能在农杆菌中进行扩增；Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。,36,双元载体系统:binary Ti vector system,37,选择标记必须具备以下四个条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；基因较小，可构成嵌合基因；能在转化体中得到充分表达；检测容易，并且能定量分析。细菌筛选标记基因：产物给予细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来，例如，Cat（氯霉素抗性基因）。植物筛选标记基因：强调给转化细胞带上一种标记，起报

23、告和识别作用，故称报告基因。,38,报告基因:Gus基因（-葡糖苷酸酶基因）在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点：在一定条件下与X-G1ucuionic acid（5-bromo-4-chioro-3-indoyl-D-glucuronic acid）底物发生作用，产生蓝色沉淀，既可以用分光光度计法测定，又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点。当加入4-甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成4-甲基伞形酮，发荧光（=465nm）。因而可以用荧光光谱法测定。由于荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。检测容易，只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定完毕。价格便宜。,39,40,GFP（

24、绿色荧光蛋白基因）LUC(萤火虫荧光素酶基因),报告基因：,41,启动子的选择,35S,cauliflower mosaic virus 35S promoter,CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues.,42,(三受体材料的选择 受体是指用于接受外源DNA的转化材料。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：1、高效稳定的再生能力；2、受体材料要有较高的遗传稳定性；3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；4、对筛选剂敏感；5、转化率高,43,常用的受体材料有以下几大类

25、型:,1.愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，转化效率高。缺点：遗传稳定性差、嵌合体，因此需要连续的再生系统。,44,2.直接分化再生系统：外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：材料局限，转化率低。,3.原生质体再生系统优点：高效、广泛地摄取外源DNA，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统；缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。,45,4.胚状体

26、再生系统：是指具有胚胎性质的个体。优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强，嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。,5.生殖细胞受体系统：以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。,46,（四）转基因方法概括起来说主要有两类：第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。第二类是外源目的DNA的直接转化。,47,1.载体介导转移系统最常见的转基因方法。将外源基因重组进入适合

27、的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcingplasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。,48,农杆菌共培养侵染,诱导愈伤组织,分化生芽,生根,叶盘转化法,(1)叶盘法 双子叶植物较为常用、简单有效的方法。,49,(2)真空渗入法将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。简便、快速、可靠，不需要

28、组织培养。(3)愈伤组织共培养(4)原生质体共培养,50,2.外源基因直接导入法（1）化学刺激法细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）(2)基因枪轰击法（微弹轰击技术micro-projectile bombardment)将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。,51,Transformation is performed by gene gun method,52,53,(3)微注射法：利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体

29、细胞。子房注射法或花粉管通道法：具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。,54,（五）转化体的筛选和鉴定1.转化体的筛选使用特异性选择标记基因进行标记，有效地选择出真正转化细胞。常用选择标记基因：抗生素抗性基因 除草剂抗性基因将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。,55,2.转化体的鉴定 通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，还必须对抗性植株进一步检测。,DNA

30、水平的鉴定 检测内容：是否整合、拷贝数、整合位置。检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物）Southern杂交（外源目的基因序列为探针）,56,特异性PCR检测外源基因整合到受体,57,(2)转录水平的鉴定常用的方法Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交）RT-PCR 检测,mRNA,cDNA,PCR,（3）翻译水平的鉴定为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。主要方法：Western杂交,58,（六）转化体的安全性评价和育种利用根据有关转基因产品的管理规定、在可控制的条件下进行安全性评价和大田育种利用研究。通过转基因方法往往难以

31、直接获得理想的品种（系）原因：外源基因失活、纯合致死、花粉致死、其它性状变化等。因此获得转化体后，应结合杂交、回交、自交等常规转育手段，最终选育综合性状优良的转基因品种。,59,转基因作物的遗传特点：少数外源基因整合到植株能稳定遗传，正常表达，符合孟德尔遗传。大多失活或表现复杂的遗传方式。原因：受宿主基因组排斥而发生片段丢失、重排；多拷贝；整合随机性。整合机制：1、同源重组2、位点特异性重组3、转座4、异常重组,60,整合后外源基因表现：不表达1、基因丢失2、基因沉默表达1、符合孟德尔遗传2、独立转化体之间存在差异3、无规律,61,转基因作物的生物安全性,62,直至今天，转基因作物的安全性在全

32、球范围内引起了激烈的争论。反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险，可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物被一些媒体称之为“恶魔食品”。（frankenstein food）。Frankenstein是英国科幻小说中由一个科学家创造、最终又毁灭了这个科学家的怪物。那么，人类研制与种植转基因作物到底是毁灭自己，还是拯救自己呢？,63,国际上有关转基因作物安全性争论的几个典型事件1Pusztai事件：英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏

33、。后果：绿色和平组织等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”，并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文都无法如期完成。英国皇家学会组织了同行评审，并于1999年月发表评论，指出Pusztai的试验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计差；统计方法不当；试验结果无一致性等。,64,2斑蝶事件：1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在Nature杂志上发

34、表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44的幼虫死亡。这一实验结果在科学上没有说服力：玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外米，马利筋叶片/CM2上只找到一个玉米花粉；2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。,65,3加拿大“超级杂草”事件：由于基因漂流，在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”，

35、并怪罪于转基因。基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。举例来说，小麦由、三个基因组组成，它是由分别带有、基因组的野生种经过基因漂流合成的。所以，以此来禁止转基因作物，也是没有道理的。,66,关于转基因植物的潜在风险:1.转基因植物释放引发“超级杂草”目前转入植物的基因以抗除草剂的为多，其次以抗虫和抗病毒，然后是抗逆。如果这些基因逐渐在野生种群中定居后，就具有选择优势的潜在可能，成为难以控制的“超级杂草”。,67,2.转基因植物中35S启动子的生物安全性最常用的启动子是35S启动子，该启动子能够在植物组织中高水平表达。

36、因此已经被引入许多转基因植物中。潜在风险问题:35S启动子内有一重组热点。（1）如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒。（2）启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成。（3）当转基因植物被动物或人类食用后，35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游，活化并且导致癌变。,68,3.抗生素抗性标记基因的生物安全性抗生素抗性标记基因是否导致的在环境中的传播。目前，转基因作物都使用细菌编码的抗生素抗性基因作为选择性标记。在过去的几年里，越来越多的报道指出:细菌可以获得对多种抗生素的抗性。这导致人们开始怀疑：转基因植物中的抗性基因是否会转移到细菌中。抗性标记基因是

37、否会通过食物在肠道中水平转移至体内微生物，从而影响抗生素治疗的有效性。抗性标记基因产物是否使人体产生抗药性（食品安全性）。,69,4.转基因食品的安全性 1994年美国Caigene公司的转基因延熟番茄经FDA批准上市，成为第一例通过安全评价的转基因植物食品。转基因食品对人类的可能危害主要有3大类：（1）可能含有已知或未知的毒素，对人体产生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的过敏源，引起人体的过敏反应。（3）食品某些营养成分或营养质量可能产生变化，使人体出现某种病症。,动 物 克 隆,克隆技术发展简史 核移植 胚胎克隆 体细胞克隆克隆羊多利诞生记动物克隆存在的问题,核移植技术：所谓核移植技术就

38、是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。胚胎克隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎，叫做胚胎克隆。体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做 体细胞克隆。,两栖类细胞核移植,1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代。核供体为囊胚期的胚胎细胞实验成功。核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞实验失败。,19

39、58-1962年，剑桥大学Gurdon和Machineer利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。1970 Gurdon用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核试验，蛙卵发育成了蝌蚪。,鱼类的核移植,从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响。,1979年，中国科学院武汉水生物研究所利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细胞经过385天59代连续传代培养后，再将此种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常

40、。1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。,哺乳类的细胞核移植,1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。,操作流程：将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有适量细胞松驰B的溶液中。经此番处理的卵细胞的染色体复制后出现了两个核，将此双核细胞放入正常培养液中培养。卵中的双核细胞自动融合，并且细胞开始分裂。将此种胚胎移入母鼠子宫培育。生产出7只单亲小鼠。,1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊

41、胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将此胚胎移入同步孕鼠子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。,核移植技术的一般操作程序,核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步骤。,1核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体

42、内成熟的M卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。,2核供体细胞的准备 在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。,3细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射是用一个外径58m 的注核针吸取供体核后直接注射进卵

43、母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。,4激活 卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态。,5重组胚的体内或体外培养 经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚

44、和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。,6胚胎移植 重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。,核移植技术的应用,1制备转基因克隆动物，进行生物药物生产；2培育优良畜种，扩大良种种群；3开展异种动物克隆，拯救濒危动物；4与干细胞技术结合，开展治疗性克隆5利用核移植技术，研究生物学的基本问题。,克隆羊与体细胞核移植,多 利 羊 诞 生 记,第一步：取妊娠期的6岁母绵羊（Finn D

45、orset白品种母羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。第二步：注射促性腺激素，促使母羊（Sottish Blackface黑面母绵羊）排卵，2833小时取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其进入G0期做受体细胞。第三步：乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新的遗传物质的卵细胞。,第四步：新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天后发育为桑椹胚或囊胚（816个细胞）。第五步：将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下多利即为6岁母羊的复制品，也为白色。,多利出生的概率,Cell

46、s taken from a six-year-old Finnish Dorset ewe and cultured in a lab.277 cells then fused with 277 unfertilized eggs(each with the nucleus removed)29 viable reconstructed eggs survived and were implanted in surrogate Blackface ewes.1 gave birth to Dolly0.361%chance at onset,3.4482%once implanted.In

47、nature between 33-50%of fertilized eggs develop.,从芬兰Dorset山羊取277 个乳腺上皮细胞与277个去核未受精卵细胞融合，得到个重建卵细胞，植入代孕黑脸母山羊子宫，产出一头克隆羊olly。起始获得概率为0.361%,植入后获得概率为3.4482%。,为何是突破性的工作：,第一，解决了使供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同步的方法。第二，解决了用体细胞做核供体与转基因的问题。,这一成果的重要生物学意义,第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且恢复了失去的全能性形成了完整个体。第二，多利是世界上首例

48、利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。它的成功提示我们可以进一步做到，在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。第三，在现代生物学领域中，沿有任何一项研究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决更多的问题的先例。多利羊的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。,克隆技术存在的问题,理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大

49、部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。,实践问题,克隆动物的成功率还很低 生出的部分个体表现出生理或免疫缺陷。即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。,The Next Step?,Highly unlikely.,Attempts at human cloning are viewed very unfavorably in the scientific community.,In Future,Thank you for your attention!谢 谢 大 家！,