3DNA重组.ppt

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1、2.DNA的复制和修复,1.绪论,目录,3 DNA重组,4.RNA的生物合成,5.蛋白质合成,6.基因的分子结构和组织,7.原核生物基因表达调控,8.真核生物的基因表达调控,Chapter 3 DNA重组,3.1 概述,3.2 同源重组,3.3 位点专一性重组,3.4 转座重组,生命学院 张林生,DNA Recombination,3.1 概述,3.1.1.DNA重组,3.1.2.生物体内的DNA重组,3.1.3.生物体内DNA重组的意义,3.1.4.DNA重组的类型,DNA重组的定义,DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组。,DNA重组的意义,重组的意义在于：它能迅速增加群

2、体的遗传多样性(diversity);是有利突变和不利突变分开(separation);通过优化组合积累有意义的遗传信息为DNA损伤或复制障碍提供修复机制某些生物的基因表达受DNA重组的调节,3.1.1 DNA重组,可发生在体内 也可发生在体外 基因工程,所有的DNA都是重组DNA。重组最明显的表现在减数分裂期第一次核分裂前遗传信息的频繁交换,使染色体混合和重排.,基因工程中的DNA体外改造和连接所引起的基因表达改变，只是模仿大自然在进化过程中进行的重组和突变而已。,3.1.2 生物体内的DNA重组,减数分裂期同源染色体之间的重组；叶绿体基因与核基因之间的DNA交换；线粒体基因间。细菌的接合：

3、细菌染色体和噬菌体的整合高等生物和原核生物的转座过程:,3.1.3 生物体内DNA重组的意义2.29,1.引起进化,变异,突变:概率低、涉及基因少,基因交换:广泛存在，主要是减数分裂中。,基因交换即DNA重组，是生物进化的主要机制。,优胜劣汰、适者生存，人工选择。,2.DNA重组调节基因表达,3.研究DNA重组有重要的理论意义,研究DNA重组有重要的理论意义,a.了解进化机制 不同生物的同源关系及 进化（基因序列的保守和差异）,b.研究转座机理，为细胞分化和发育提供 理论依据。,c.转座引起基因调控：如肿瘤发生机理 某些基因的启动等,d.进行基因标记，检测突变基因位置和 分离突变基因。,e.为

4、基因工程操作提供理论依据,f.重组技术为研究基因重组开辟途径,3.1.4 DNA重组的类型,根据重组过程对DNA序列和所需蛋白因子的要求分为：,同源重组：,真核生物姊妹染色单体和非姊妹染色单体的 交换。,细菌及某些低等真核生物的转化。,细菌的转导，接合。,转座重组：,不要求转座位点区段序列同源性，转座 子的转移和插入。,造成转入位点DNA混乱，如缺失、倒位、重排。,异常重组：,不需序列同源性，不需重组酶参与。,位点专一性重组：直接在专一序列之间配对而发生 的重组。,噬菌体溶原途径中的整合。,抗体基因的重排。,只需短的同源序列、蛋白因子、整合酶。,3.2 同源重组,3.2.1 何谓同源重组,3.

5、2.2 同源重组特点,3.2.3 同源重组的功能,3.2.4 同源重组机制,3.2.1.同源重组(homologous recombination),同源重组广泛存在于生物界。如真核生物姊妹染色单体的交换；细菌及某些低等真核生物的转化；细菌的转导、接合等。,同源重组的概念:同源重组(又称基本重组)（交换crossing over)它是由两条同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片段交换(crossing over)的过程。在真核生物中，重组在雄性和雌性中都是发生在减数分裂时期，在雄性中发生在精子发生期，雌性发生在卵子发生期。这时候是减数分裂的“四链期”，四条链中只有两条参与重组

6、。,This recombination involves the physical exchange of DNA sequences between the chromosomes.,1.在真核中同源重组也称交换（crossing over),指减数分裂过程中染色体间的物质交换，即DNA分子的断裂和在重组酶作用下的交换连接。,2.细菌没有减数分裂，同源重组发生在接合过程中，交配的染色体在两个紧密连接的细胞中转移。,3.减数分裂期染色体变化和发生交换的DNA分子的相互作用。（图 3 1）,图3-1 真核生物的同源重组发生在减数分裂时，姐妹染色单体 间遗传物质间的交换；,同源重组发生在减数分裂

7、前期，分5个阶段：,细线期：也是减数分裂标志，染色体清晰可见。,合线期：染色体开始靠近，在几个同源区配对，一 个基因组上DNA断裂，重组开始。,粗线期：联会【染色体配对沿整个配对染色体展开，形成二价体（bivalant)】，DNA单链与另 一基因组发生交换。,双线期：染色体分离，但在交叉点,链交换区延伸。,终变期：染色体凝聚，从被膜分离，保留交叉，四 条染色单体全部变清晰。,DNA拆分，通过单链切割释放基因组。,显微镜下的同源重组:,细菌的同源重组发生在接合过程中，交配的染色体在两个紧密接触的细胞中转移。,4.重组修复中也发生同源重组。（图3-2）,图3 2 修复途径中随着适宜底物DNA分子的

8、产生，细菌能催化重组的所有阶段,损伤DNA产生缺口,RecA使链交换,第二次链交换,DNA聚合酶通过DNA合成填满缺口,RuvA,B分支迁移,RuvC切割Holliday连接点,3.2.2 同源重组特点,1.要求较大的DNA片段进行交换。,2.存在重组热点。,3.整个基因组重组频率不稳定，受综合效应 和局部效应影响。,4.同一条染色体上的两个基因间发生交换的 频率取决于他们之间的物理距离,相距越远 越容易发生交换,5.DNA分子的断裂和再结合是同源重组的主要 特点,3.2.3 同源重组的功能,1.维持生物种群的多样性。即遗传多样性.,2.染色体瞬间的物理连接，对染色单体正确分离到子代细胞至关重

9、要。,3.用于损伤修复。以未损伤的同源染色体修 复因损伤而丢失的染色体序列.（图3-2）,4.通过重组可调控基因表达.,3.2.4 同源重组机制,由Robin Holliday在1964年首先提出，后由David Dressler和Huntington Potter 在1976年提出修改，他们证明了Holliday中间物的存在。,同源重组的Holliday模型,同源重组需要的条件,1.两个同源染色体DNA排列整齐2.一个DNA的一条链断裂3.链侵入，并与另一个DNA对应的链连接，形成的连接分子（joint molecule），称为Holliday中间体（Holliday intermediat

10、e）。4.通过分支移动(branch migration)产生异源双链(heteroduplex)DNA。5.Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。,3.2.4.1 断裂复合（breakage and reunion),A.断裂-复合机制的两种假设a.完整DNA分子的断裂和重接：染色体复制完成后，每对联会染色体有4个 染色单体。染色单体收缩产生张力引起DNA整体断裂，断裂的DNA交叉重接解除张力，形成交换产物。,发生在染色体复制完成后，每对联会染色体有4个染色单体。在染色单体水平发生DNA整体断裂。断裂的DNA交叉重接，解除张力。,配对的染色体在复制中途，交换了各自的 模

11、板。（图3 3）,b.拷贝选择,姊妹染色体复制中途交换了各自的模板,B.断裂-复合中的几个概念,a.异源双链（heteroduplex）：在重组部位，每个双链中均有一段DNA链来自另一个双链中的单链。这个部分称为异源 双链（杂种DNA）。,b.分支迁移,指异源双链交叉连接中以拉链式效应扩散。,分支迁移：异源双链交叉连接中，交叉点沿着两条双链移 动，称为分支迁移（branch migration）。,分支迁移,c.Holliday结构：两个DNA分子交 叉重组时，在连 接处则形成一个“四螺旋”作为中 间物。这种结构 称为Holliday结 构（交叉结构）。,双链侵入、单链侵入和双链断裂修复等均可

12、形成Holliday结构（Robin Holliday，1964）。,构（Robin Holliday，1964）。,连接分子的拆分:,Holliday结构可发生立体或空间重排，使得作为“桥”的链（即连接两条螺旋的交叉部分）转变为“外部”链，而原来的外部链则转变为“桥”链。,最后由核酸酶将交叉处切断（解离resolution）而完成重组作用。这种异构转变可导致两条子链发生双重交换，或所有四条链发生单交换。,重组体,重组体,3.2.4.2 双链断裂启动重组（双链断裂模型）,在受体DNA链上形成双链断裂；通过核酸内切酶扩大受体切口，产生3-端单链；受体3-端迁移至供体同源区；受体3-端修复延伸合成

13、；供体置换、链迁移至受体链；在受体上的另一个3-端DNA合成；相互迁移产生双链交换。,在受体上的另一个3-端DNA合成；相互迁移产生双链交换。,图3-8,图3-9,Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但也存在问题。该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂。Meselson M和Radding C对此提出了修正意见，他们认为同源DNA分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一DNA分子的同源区，造成链的置换，被置换的链再切断并与最初断链连接，即形成Holliday中间体(

14、Meselson-Radding model)。但是也有事实表明，重组是由双链断裂所启动。DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换，籍以将同源染色体分配到子代细胞中去（Double-Strand Break Repair Model）。,细菌的接合作用（conjugation）,细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞，称为接合作用。供体细胞被定义为雄性，受体细胞为雌性。通过接合而转移DNA的能力是由接合质粒（conjugative plasmid）提供的，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子（fertility fact

15、or），简称为性因子或F因子。,细菌的同源重组发生在接合过程中，交配的染色体在两个紧密接触的细胞中转移。,受体,大肠杆菌主要的重组蛋白,RecARecBCD RuvARuvB RuvC,RecA蛋白,RecA蛋白是一种多功能蛋白质，它参与大肠杆菌所有的同源重组途径，有单体和多聚体两种形式。多聚体由单体在单链DNA上从53方向组装而成。RecA的主要功能包括：（1）促进2个DNA分子之间链的交换；（2）作为共蛋白酶促进LexA 阻遏蛋白的自我水解RecA蛋白在同源重组的具体作用分为3个阶段：（1）RecA的第一个DNA结合位点（初级位点）与单链DNA结合，包被DNA，形成蛋白质-DNA丝状复合物

16、；（2）RecA的第二个DNA结合位点（次级位点）与1个双链DNA分子结合，形成三链DNA中间体，随后单链DNA侵入双链DNA，寻找同源序列；（3）RecA催化链交换，由被RecA包被的单链DNA从53方向取代双链DNA分子之中的同源旧链，形成异源双链，并发生分叉迁移,RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间的交换,RecA蛋白促进单链DNA与双链DNA进行链交换,RecA蛋白单体的三维结构模型,RecA介导的链交换,RecBCD蛋白,由RecB、RecC和RecD三个亚基组成。具有5种酶的活性外切核酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶。RecBCD蛋白参与细胞内的RecBC

17、D同源重组途径首先它与双链DNA分子自由末端结合，依靠其外切核酸酶V的活性同时降解DNA的2条链，然而，一旦遇到chi（）序列，RecD亚基就从复合物中释放出来，留下来的RecBC蛋白开始以解链酶的活性发挥作用，在水解ATP的同时，解开DNA双链，产生单链DNA，为RecA发挥作用铺平道路，最终起动了链交换和重组反应。,RecBCD蛋白的作用模型,RuvA和RuvB,DNA解链酶催化分支迁移RuvA四聚体与Holliday连接结合（两个亚基之间结合一个DNA螺旋）RuvB 是六聚体环，具有解链酶和ATP酶活性 2个拷贝的RuvB与Holliday连接结合（结合到RuvA和2 个DNA螺旋）分支

18、迁移沿着RecA介导的链交换方向进行,RuvA的三维结构,RuvA和RuvB的作用模型,RuvC的作用模型,RuvC蛋白,是一种特殊的核酸内切酶，催化Holliday结构的分离，因此被称为解离酶。以对称的二聚体形式发挥作用，在Holliday结构的中央部位切开4条链中的2条，而导致Holliday结构的拆分。RuvC的作用具有一定的序列特异性，它作用的一致序列是5-(A/T)TT(G/C)-3，箭头为切点，因此，只有当分支迁移到该一致序列的时候，RuvC才有机会起作用。,The RuvABC Proteins&Migration of Holliday Junctions,5.Migratio

19、n increases the length of heroduplexes,allowing for isomerization of Holliday Junctions.,6.RuvA binds&stabilizes Holliday Junction,7.RuvB then binds to RuvA/DNA complex,9.Isomerization probably does not require proteins or energy.,Fig.22.31a,RuvC的作用模型,大肠杆菌几种重要的同源重组途径,（1）RecBCD途径 这是大肠杆菌最主要的重组途径。除了Rec

20、BCD以外，还需要RecA、SSB、RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶I、DNA 连接酶和DNA旋转酶。此外，还需要chi序列。（2）RecF途径 这主要是质粒之间进行重组的途径，需要的蛋白质有RecA、RecJ、RecN、RecO、RecQ和Ruv等。（3）RecE途径,Fig.22.5 a-e,RecBCD同源重组途径,3.3 位点专一性重组(site-specific recombination),3.3.1 概念,3.3.2 位点专一性重组机制,3.3.1 概念,1.定义：,在专一酶的作用下，在DNA特定位点上发生断裂和重接，从而产生精确的DNA重排的DNA重组方式。噬菌体溶原

21、途径中的整合、抗体基因的重排等都是位点专一性重组。,2.特点：,需DNA专一识别位点，而非DNA同源序列引导，即只涉及短的同源序列。需专一的酶来识别和结合并作用。参与位点专一性重组的酶的表达被细胞中调节过程引发。重组后，原先存在的DNA顺序全部被保存下来，并无丢失（保守重组）。,3.位点专一重组与同源重组的区别,位点专一 同源,位点 同源短序列 同源大片段,酶、蛋白 专一 RecA,断裂 专一 随机,3.3.2 位点专一性重组机制,3.3.2.1-phage 的溶源和溶菌途径,1.溶源途径：在溶源途径时，-phage DNA能通过重组作用整合进E.coli染色体的特异位点，成为前病毒（prov

22、irus、前噬菌体，prophage）。,2.溶菌途径：在溶菌状态时，-phage DNA以环状分子独立存在于寄主细胞中；（图3-10）,3.3.2.2 DNA与E-Coli 染色体的重组机制,1.基本特征（同一般位点专一性同组）,典型的保守性重组，交换是相互的，并保存原DNA。,需两个重组前体的DNA短同源序列 中专一性核苷酸序列,噬菌体的DNA借着att与大肠杆菌的DNA靠在一起后，其整合酶即与att结合，催化整合反应，将两个环状DNA分子变成一个大环。,代表：低等生物-DNAE.Coli-DNA。高等生物 抗体基因形式。,噬菌体DNA编码的整合酶（integrase）能指导噬菌体DNA插

23、入E.coli染色体中。噬菌体和宿主的DNA分子都有特异位点（小段同源序列，称为附着点att，attachment site)。,噬菌体的整合（integration）,2.位点专一性重组的机制,E.Coli-DNA-DNA,附着点 attB attP,序列 BOB POP,专一性同源序列 0 0,重组后新产生序列 attL attR,整合所需序列 attB attP,切除所需序列 attL(BoP)attR(PoB),细菌DNA和-DNA的专一附着位点,噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点为attP和attB。,attB和attP中有相同的核心序列。整合酶与两个核心相结合。整合酶不但要求

24、特异的序列，且要求两个核心序列有同源性。,图3 11 通过在attP和attB间的相互重组,环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体,原噬菌体通过attL和attR间相互重组而切除.,整合需要lnt整合酶&lHF整合宿主因子,切除需要lnt、xis切除酶&lHF,整合蛋白,整合作用几乎发生在每个被侵染的细胞中。,a.整合酶：-DNA编码，-phag侵染早期即产生有高活 性。,整合过程需要整合酶和整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）。,b.宿主整合因子IHF（intergration hostfactor),Him突变阻止位点专一性重组的发生。,int（原噬菌

25、体整合和切离基因）突变会抑制him基因突变。,IHF与int相互作用导致重组。,切除需要int、Xis和 IHF，其中Xis蛋白控制反应方向，Xis抑制整合作用（图3 11、12）.,MW:20KD、两个亚基，由HimA、HimD编码。,编码：E.coli 染色体DNA。,图3 11 通过在attP和attB间的相互重组,环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体,原噬菌体通过attL和attR间相互重组而切除.,整合需要lnt&lHF,切除需要lnt、xis&lHF,整合反应,a.体外研究方法：用自杀性底物（suieide substrate)终止中间体形成。整合核心序列造成缺口，干扰重组进 行

26、，即只切不连，得到中间体，研究 中间体结构。,自杀性底物:具有类似于底物的结合和反应基团,可结合于酶的活性部位并在其作用之下发生反应;与底物不同的是它还有潜伏的反应基团,受酶催化之后即被活化,与酶活性中心基团共价结合,使酶丧失活性.,互补连链末端进行交叉杂交（互补单链为7b),b.整合过程：,intf蛋白切断DNA,attP(上）和attB(E.coli上）发生交叉互补断裂,封闭连接端切口,Int蛋白松弛负超螺旋（attP上）。,离体反应需要在attP上有超螺旋，而attB则不需要。（图3 13）,互补末端退火 attp形成超螺旋,图3-13,图3 11 通过在attP和attB间的相互重组,

27、环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体,原噬菌体通过attL和attR间相互重组而切除.,整合需要lnt&lHF,切除需要lnt、xis&lHF,attB和attP中有相同的核心序列。整合酶与两个核心相结合。整合酶不但要求特异的序列，且要求两个核心序列有同源性。,整合时int识别attP，int和IHF结合形成整合体(intasome)。IHF是由基因himA和himD编码的2个亚基组成的蛋白。him基因突变会阻断位点特异性重组，也能被int突变所抑制，表明IHF和Int可相互作用。位点特异重组可通过Int和IHF在体外来完成。它涉及精确的断裂和重接而不需要任何DNA合成。attP的功能需要一

28、个240bp序列，而attB仅需23bp的片段就具有功能，核心区每侧仅需4bp。在核心区中有7bp是交错剪切的序列。attB和AttP的大小就表明它们在重组中所起的作用是不同的。AttP提供了附加的信息，以区别于attB。很多位点特异重组复合体都是调节反应所需的，所以当病毒进入溶原状态时整合先进行；当原噬菌体进入裂解周期时，先进行切离。通过Int和Xis量的控制将进行相应的反应。,（图3 14）,c.整合体：识别和形成复合体,Int和IHF结合在attp不同位点上,Int在核心区的识别序列包括切割位点,3.位点专一性重组调节基因表达,重组位点的取向可导致插入片段除去或倒转。在一个DNA分子上两

29、个特异位点之间发生重组，会得到两种结果：两个位点之间的片段丢失，或被颠倒。有些生物能利用这种重组倒置来控制基因表达。DNA的一正一倒两种排列法可以相应地表达两种蛋白质，细胞可根据需要作出选择。（图3-15）,重组位点取向相反：插入片段倒转。,重组位点取向相同：插入片段除去。,(在基因工程中有意义),生物利用这种机制常常调节体表蛋白的表达。如：锥虫（trypanosomes）的表面抗原千变万化，用以逃脱宿主免疫系统的攻击，这也是通过一系列DNA重排达到的。沙门氏菌（如鼠伤寒沙门氏菌，Salmonella typhimurium）的鞭毛抗原表达也是这个机理。,3.4 转座重组,3.4.1 生物体的

30、基因组可通过获得新序列 发生变异而进化,3.4.2 转座子（transposon or transposable element)概述,3.4.3 转座子的转座机制,3.4.4 转座子的某些遗传效应,DNA的转座（移位，transposition）是由可移位因子（transposable element）介导的遗传物质重排现象。是1951年美国遗传学家McClintock在根据玉米染色体的长期观察研究提出的概念。,3.4.1 生物体的基因组可通过获得新序列发生变异而进化,获得新序列的途径,通过载体导入DNA至受体基因组（如根癌农杆菌的Ti-质粒）。,细菌质粒通过接合作用转移信息（F-因子使质粒

31、转移）。,噬菌体通过侵染传递信息。,质粒或噬菌体与寄主染色体重组（转化、偶然、随复制子）。,病毒侵染（如真核逆转录病毒）,基因重排产生新基因（抗体）。,转座子的转座作用使现存序列、位置改变。,3.4.2 转座子（transposon or transposable element)概述,转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。1.转座子:即能够反复插入到基因中许多位点的特殊DNA片段，它们可从一个位点转移到另一个位点,从一个复制子到另一个复制子。（在转移时原来位置上的这些结构依然存在或不存在）。,在转座过程中，转座子的一个拷贝常留在原来位置上，在新

32、位点上出现的仅是拷贝。它依赖于DNA的复制。,供体,受体,2.特点：,（1）不必借助同源序列就可移动的DNA 片段，即转座作用与供体和受体之 间的序列无关。,（2）原核生物和真核生物均有转座子。,（3）转座序列可沿染色体移动，甚至在 不同染色体间跳跃。,40年代，B.Mcclintock(美）在研究玉米行为遗传学中发现玉米粒上有色素和斑点的变化，提出在生物体基因中有可移动的控制因子（controlling element)。这些控制因子相连接的基因往往变得不稳定。（1952年发表其论文）。,1968年 Jordan在细菌中也证明了有转座子，Mcclintock的理论才引起重视，并于1983年获

33、诺贝尔奖。,3.转座子的发现：,转座子发现者B.Mcclintock(美）,McClintock在1952年发表了关于转座子的论文，但在1967年Shapiro从E.coli中发现了转座子后，Mcclintock的理论才引起重视，1980年获诺贝尔奖。Shapiro在gal操纵子中发现一种极性突变。gal操纵子的galK、T、E基因分别编码gal激酶（galactokinase,K）、gal转移酶（galactose transferase,T）和gal表异构酶（glactose epimerase,E）。,因此能生长的应是galT的回复突变及突变体galKgalT。但意外发现galEgalT

34、也能生存，这种突变型由于Gal-1-P积累是不可能存活的，但却居然生长良好。其原因是由于galE是极性突变，它的突变使远离操纵位点的galK活性大大下降，因而细胞中不会积累Gal-1-P。,K、T、E酶催化Gal的分解，其中间产物Gal-1-p是有毒的，因此galT在含半乳糖的培养基上因使Gal-1-p积累而不能成活。,这种极性突变不同于一般的极性突变，它的特点是：能回复突变，表明不可能属于缺失或移码突变；用诱变剂对其处理并不能提高回复突变率，因此推测可能不是点突变。因此推测galE的突变可能也是部分DNA的插入（突变）和切离（回复突变）所致。Jordon、Starlinger和Shapiro

35、等设计了一系列实验来证实这一想法。,密度梯度离心实验：Jordon、Starlinger和Shapiro等分别进行了实验，他们将含有gal+和galm(极性突变，即gal)噬菌体分别分离出，同时加入到离心管中进行密度梯度离心，结果出现了两条带，galm的密度gal+,表明galm有可能具有小片断DNA的插入。,分子杂交实验：将galm和gal+进行分子杂交，若有galm有额外片段则在电镜下可观察到它们的存在和所处的位置。实验结果在杂交链上出现了一个额外的茎环结构，长800nt（核苷酸）的就是插入序列1（insertion sequence1，IS1）。,gal+/galm杂合双链DNA的电镜照

36、片，出现了棒糖状结构。,DNA的转座（移位，transposition）是由可移位因子（transposable element）介导的遗传物质重排现象。是1951年美国遗传学家McClintock在根据玉米染色体的长期观察研究提出的概念。McClintock首先观察了玉米中转座因子。她研究的性状之一是玉米胚乳上的色素。当时已知很多基因共同控制红色花青素的合成，使玉米胚乳呈紫色。这些基因中任何一对基因发生突变都会影响色素的合成，使胚乳呈白色。,转座重组,DNA的转座（移位，transposition）是由可移位因子（transposable element）介导的遗传物质重排现象。,4.转座子

37、的种类和结构特征：,原核中的转座子有两类：,简单转座子也称插入序列（insertion sequence IS).,复合转座子（composite transposon),转座子的结构特征,两端有20 40bp的反向重复序列（inverted repetitive sequence)。,具有编码转座酶的基因（transposase)。,复合转座子除转座酶外还有1数个基因。,转座酶催化转座子插入新位点。,转座子的结构特征：两端具有2040bp的反向重复序列（inverted repetitive sequence,IR)或正向重复序列（direct repeats,DR）。具编码转座酶(tran

38、sposase)的基因，转座酶可催化转座子插入新位置。,插入序列（insertion sequence，IS）IS（最简单的转座子）。,不含有任何宿主基因。简单转座子是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。IS中则仅含有编码其转位所需的转座酶（transposase）的基因。表示法：IS 加鉴定类型的编号。,来源：在细菌操纵子中以自发插入形式鉴定出来，是细菌质粒和染色体的成分。此类基因一般长有约1000bp左右，最小的 IS 1为768bp，最长的208

39、8bp（表3-1）,表3-1 某些 IS 序列的参数,IS1 768 23 9 随意,IS2 1327 41 5 热点,IS4 1428 18 11 或 12 AAAN20TTT,IS5 1195 16 4 热点,IS10R 1329 22 9 NGCTNAGCN,IS50R 1531 9 9 热点,IS903 1057 18 9 未知,IS是一自主单位，每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式（图3-16）。,图3-16,IS1 的序列1978年由H.Ohtsubo 和E.Ohtsubo 测定。,反向重复（IR）IS 末端只有反向,顺向重复,末端反向/顺向重复序列的效应不同！,转座子两边

40、的反向重复序列变性后形成的发夹结构,IS具有1kb左右的编码区，它仅编码和转座有关的转座酶（transposase）。IS对靶的选择有：随机选择、热点选择和特异位点的选择。,IS的转座是在转座酶催化下交错切开宿主靶位点，然后IS插入，与宿主的单链末端相连接，余下的缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补，结果使插入的IS两端形成了DR。,复合转座子（composite transposon）,复合式转座子（Tn）是一类除了含有转座酶基因外，还带有其它基因（如某些抗药性基因或其他宿主基因）的转座子。表示法：通常以Tn和后面加上数码表示，如Tn903。,除有转座酶基因外还有其它表型基因，如：抗药 基因，

41、使宿主具表型效应。两侧有重复序列。有的转座子的重复顺序就是IS。（图3 20）,结构：,Figure 3-20 A composite transposon has a central region carrying markers(such as drug resistance)flanked by IS modules.The modules have short inverted terminal repeats.If the modules themselves are in inverted orientation,复合式转座子两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。,复合式转座子两

42、翼序列表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。,表3-2 几种复合转座子,Tn903 3100 Kanr IS903 反向 完全相同 两者皆有,Tn9 2500 Canr IS1 正向 可能相同 可能有,Tn10 9300 tetr IS10R/IS101 反向 25%差异 有/无,Tn5 5700 Kanr IS50R/IS501 反向 1 bp 变化 有/无,转座噬菌体 Mu 和 D108,是一类温和的噬菌体，温和噬菌体可致突变。温和噬菌体一般整合到寄主染色体的一定位置上。但 Mu没

43、有一定的整合位置（随机整合）引起突变。,M u的特点：,a.Mu不是细菌染色体的正常成分。易判断带Mu和不带Mu的两种细菌。,b.Mu可被诱导，更易制备。,3.4.3 转座子的转座机制,1.转座的一般模式（图3-22）（图3 23、24）,转座酶（transposase）与转座子两端以及将要插入的DNA靶序列相结合，然后转位酶在靶上交错切割，同时在转座子的两条不同的链两端各进行单链切断。产生的转座子游离端和靶序列的游离端相连接，成一个DNA分子。转座时，受体DNA的靶序列（312bp）被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。,Figure 3-22 Transposons have i

44、nverted terminal repeats and generate direct repeats of flanking DNA at the target site.In this example,the target is a 5 bp sequence.The ends of the transposon consist of inverted repeats of 9 bp,where the numbers 1 through 9 indicate a sequence of base pairs.,Figure 3 23 The direct repeats of targ

45、et DNA flanking a transposon are generated by the ntroduction of staggered cuts whose protruding ends are linked to the transposon.,Figure 3-24 Transposition is initiated by nicking the transposon ends and target site and joining the nicked ends into a strand transfer complex.,2.复制型转座（replicative tr

46、anspositionJJ),转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供体的 原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。,需两种酶：,转座酶：作用于靶位点和原来转座子两端。,解离酶：作用于复制后的拷贝。（图3 17）,图3 17,3.非复制型转座（nonreplicative transposition),转座子从供体一个位点转移到受体新位点处，供体位点留下缺口，受到损伤（严重时致死）或宿主修复系统识别修复。,只需转座酶（图3 18）,图3 18,4.保守型复制（conservative transpositionJ),为非复制型转座，类似整合机制

47、，所有序列成员全部保留。（图3-19）,图3-19,3.4.4 转座子的某些遗传效应,1.引起插入突变,以 10-310-8 频率进行的转座会引起插入 突变。IS、Tn 和 Mu 噬菌体都可能引起 插入突变。,插入位点若在一个顺反子（cistron)的 前端功能基因中，可能造成极性突变（移码或终止密码突变）。,IS 和 IS2碱基序列中有无义密码子。,表3-3 几个插入序列IS引起的可能突变类型,突变类型 极性或非极性 极性或非极性 极性,插入方向 单向或双向 单向或双向 单向,可能出现新启动子,2.造成插入位点靶DNA的少量碱基对重复,IS1、Tn10：造成9bp的重复。,IS3：造成3或4

48、bp的重复。,IS4：造成11bp的重复。,3.插入位点出现新基因,复合转座子带有抗性基因（如抗药性基因ampc)，可产生两方面效应：一个基因的插入突变；出现抗药基因。,4.供体序列不变,如：复制型转座，大部分转座属于此类。,5.引起染色体畸变,在一个染色体上（甚至不同染色体上）若有同一转座子的两个拷贝，其提供的相同重组位点，可导致缺失、倒位、插入。,方向相同：产生缺失。（图3 25）,方向相反：发生倒位。（图3-26）,Figure 3 25 Reciprocal recombination between direct repeats excises the material betwee

49、n them;each product of recombination has one copy of the direct repeat.,方向相同：产生缺失。,Figure 3-26Reciprocal recombination between inverted repeats inverts the region between them.,方向相反：发生倒位。（图3-26）,图3-15,6.切除效应 3.9,指转座子从原来位置上消失。,准确切除：使原插入发生恢复突变。,不准确切除：留下转座子残迹，产生 插入突变，但转座子标志消失。,3.4.5 转座子效应的意义,1.可使原来相距较远

50、的基因组合在一起，形成一个操纵子。2.产生一个新蛋白，把原来两段分离的 DNA序列连在一 起。3.启动子部位的插入可使基因打开或关闭。4.过多转座（频率过高）对细胞不利，细胞在长期进化中形成了一些不利于转座的代谢途径，可与转座过程平衡。5.转座基因插入时，大多数受体基因均被钝化，但也有基因被激活。（这是因为转座子有自己的启动子，在使转位酶转录的同时，也可使相邻基因转录）。,3.4.6 反转录转座子(retrotransposon或retroposon)指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。这样的转座过程称为反转座作用(retrotransposition)。反转座作用出现在真