菌种保藏冷冻干燥管的制备.ppt

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1、菌种保藏冷冻干燥管的制备,河北科技大学生物科学与工程学院河北省发酵工程技术研究中心徐亲民,2,水分在冰冻状态下直接升华而干燥冷冻干燥的三要素：真空降低水的蒸汽压以加速水分的蒸发冷冻使水蒸气冷凝以减轻真空泵负荷,加速干燥温度达到进一步加速干燥的目的冷冻干燥的优点：对微生物的生物活性影响小所得干粉疏松，溶解性好水分含量低由于同时满足干燥和真空两个菌保要素,因而保存时间长,保存过程不易失活和退化,冷冻干燥原理,3,取质地均匀、厚实(壁厚1 mm)、无毛点、无气泡的硬质玻璃专用菌种冷冻管（图1），清洗干净后在管内放置打印有菌种简略名称和编号的纸条标签（图1左边的单管式冷冻管置于熔封区和装液区之间，右边

2、的套管式冷冻管置于内外管之间），单管式冷冻管管口和套管式冷冻管内管管口插入缠绕松弛的棉签，用牛皮纸包裹，于121灭菌30分钟，取出置37孵育24小时，重复灭菌一次，105110烤干（有硅胶指示剂的要使硅胶达到深蓝色），置干燥器内备用。,冷冻管的准备,4,图1 用于冷冻干燥菌种的两种冷冻干燥管,推荐尺寸：(左)8100，璧厚1 mm，球径12 mm；(中、右)外管12100，璧厚0.8-1 mm；内管950，壁厚0.5 mm。,5,取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的牛奶200 g，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮，如此重复两次。然后分装入两个250 ml锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸

3、包头、扎牢，在110下灭菌15分钟，冷却后备用。如灭菌后放置时间超过24小时，则应弃用。也可以购买袋装或盒装的超高温灭菌优质脱脂牛奶直接使用，无需再灭菌。或将脱脂奶粉制成还原乳，同上灭菌后使用。,脱脂牛奶的准备,6,选生长饱满且无菌检查合格的新鲜菌种斜面或米孢子，加入适量灭菌脱脂牛奶(一般每支中试管斜面加10 ml脱脂牛奶，或每10 ml脱脂牛奶中加1 g米孢子粒)，用自制接种耳(图2)将斜面上的菌苔轻轻刮下(注意不要刮坏琼脂表面)，或在强力振荡器上将米孢子粒上的孢子震落，摇匀，用灭菌吸管或长针注射器吸出牛奶菌悬液，置于预先灭菌的空试管内。以上操作应在无菌室内的超净工作台上进行。,菌悬液的制备

4、,7,图2 自制接种耳和长嘴毛滴管,8,将牛奶菌悬液用长针注射器或长嘴毛滴管(图2)分装入灭菌冷冻管内(注意不要使牛奶玷污纸条标签)，视冷冻管的大小每只0.30.5 ml(单管式冷冻管球形装液区内的装液量应为球体积的一半左右，套管式冷冻管内管的装液高度与管直径相当)，取出棉签棒，留置棉花，置于冷冻干燥机内冷冻干燥24小时左右。冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上再开泵。根据设备情况，有的在冷冻干燥前还要先用液氮或干冰对菌悬液进行预冻。另外，要根据冷冻干燥机的水分蒸发能力，确定一次放入的冷冻管数量。,冷冻干燥,9,确认菌悬液是否已经干燥的方法是一看真空度，二看冷冻室温度。当水分已经蒸发完，即水蒸汽

5、分压接近零时，真空度将达到最高值而不再上升；由于蒸发是一个吸热过程，在整个冷冻干燥过程中冷冻室的温度将会维持很低，使菌悬液一直处于冻结状态，当没有水分的继续蒸发后，冷冻室不再吸热，温度开始自然上升。确认干燥后，要先开启冷冻室的进气阀，让真空释放，然后停泵，打开冷冻室，将冷冻干燥管取出。为了确保冷冻干燥管内的菌粉不被污染，在冷冻室进气口应装有空气过滤器。,干燥的确认和停机,10,用自制简易冷冻干燥机进行冷冻干燥管的冷冻干燥，效果优于外购冷冻干燥机。制作方法如下：自制两只1升左右的不锈钢缸子，一只作为真空冷冻干燥室，另一只作为冷凝室，在两个缸子的齐口处焊接宽边不锈钢圈，上面有一只能连接真空泵的加厚

6、透明有机玻璃盖(便于观察内部)，用硅橡胶圈使缸子与缸盖密封。另外买一只23升的不锈钢真空保温桶，作为液氮罐(最好是专用液氮罐)，其口径应能使上述缸子坐入保温桶，而钢圈架在桶沿上(图3和图4)。,简易冷冻干燥机的制作,11,图3 自制简易冷冻干燥机(方案一),至真空泵,真空保温桶(液氮罐),液氮,冷冻真空室(放冷冻干燥管),硅橡胶密封圈,进气阀,冷凝室,厚壁软管,真空表,12,图4 自制简易冷冻干燥机(方案二),13,操作前，将冷冻干燥室和冷凝室清洗干净，控干后用酒精棉擦拭冷冻干燥室内腔，然后在顶盖上的进气管内塞入棉花，关闭进气阀门，连接好真空管线，将冷凝室座入加满液氮的保温桶内，先把冷冻干燥管

7、放入冷凝室内预冻30分钟，移入冷冻干燥室，开启真空泵，进行冷冻干燥。冷冻管内菌悬液确认干燥后，缓慢开启冷冻干燥室的进气阀，释放真空，关真空泵，取出冷冻干燥管进行真空熔封。这一简易冷冻干燥机也可用于其他生物样品以及对热不稳定的水溶性化学和生化样品的冻干。,简易冷冻干燥机的操作,14,冷冻干燥后的冷冻管取出后，立即插入多歧管（图5）的连接硅胶管内，连接并开启高真空泵，确认达到最大真空后，在继续抽真空下用煤气喷灯或天然气喷灯或丁烷气喷灯对准冷冻管的熔封区熔融封口，用电火花枪检查真空度合格后放4冰箱保存。这一封口过程技术难度较大，需要有经验的技术人员或技工去操作。,手工封口,15,图5 手工真空熔封冷

8、冻干燥管的多歧管,真空表,阀门,抽真空,连接冷冻管的硅胶管,16,利用一边抽真空一边旋转的安瓿真空封口机，可以高质量地将冷冻干燥后的菌种管真空封口。这种安瓿真空封口机如图6所示。操作步骤如下：将燃气瓶上的燃气软管与燃气连接口连接（设备后面混合三通右下方针型调节阀连接口）将待熔封的安瓿插入安瓿夹具（配重夹具），轻轻旋紧螺旋夹，加上适当重量的配重砝码。调节真空头的高度，使其与安瓿口的距离约25 mm。抬高安瓿和配重夹具，使安瓿口与真空头相连。插好电源插头，开启电源开关，真空泵和带动真空头旋转的单相电机同时启动。开启真空转换开关，使真空与安瓿连通，安瓿在旋转状态下抽真空。,机器封口（一）,17,转动

9、燃气喷头使其离开安瓿，慢慢地开启燃气针型阀，用打火机点燃燃气。开启气泵开关，分别调节空气调节阀和燃气调节阀使火焰大小适中并呈蓝色。调节燃气喷头的位置，使两束火焰尖头指向安瓿熔封位置。火焰很快将安瓿烧软，并在配重夹具重力的作用下拉伸，同时在真空的作用下收缩，最终完全熔封并被拉断，从而完成自动熔封过程。将熔封后的安瓿从夹具上取下，把熔封拉断处的尖头置于火焰上烧圆并退火。关闭真空转换开关，切断真空与安瓿的连通，用镊子取下真空头上的安瓿残端，插上新的安瓿，开始第二轮熔封。,机器封口（二）,18,图6 立式真空熔封机,19,图7 卧式真空熔封机,20,立式机使用配重砝码的重量以在旋转抽真空状态下安瓿不从

10、真空吸头上脱落为限；卧式机安瓿口与真空吸头的距离以安瓿夹牢后所能拉伸的距离为限，大约为30-40 mm。如果安瓿口太小，不能将真空头插入，可在安瓿口上套一根20 mm左右长的硅胶管，再与真空头连接；手持燃气喷灯应使高温焰对准熔封部位，并随着安瓿的拉伸向安瓿端移动，以免安瓿端拉丝过长熔封后容易碰断；,安瓿真空熔封机使用注意事项(一),21,燃气喷灯的点火、调温、熄火、充气操作应严格按喷灯所附说明书进行；熔封好的安瓿不能倒放在冰凉的桌面上，以免骤冷爆裂，应当插入特制的安瓿架；千万不要用手去取下真空头上的安瓿残端，以免烫伤；工作结束后关闭燃气喷灯，放在安全并远离火源的地方。,安瓿真空熔封机使用注意事项(二),22,外观检查：冷冻干燥结束后，冷冻管内干燥物成疏松的固体团块，体积应保持与原液体体积相同，而且在长时间保存后不收缩，变色硅胶呈深蓝色。另外，每个月还要对冷冻干燥管定期检查一次，如发现硅胶蓝色变淡、变红，干燥菌粉吸潮收缩，则应予以淘汰，不能继续保存。真空度检查：电火花真空枪检查可见淡蓝色电火花通过真空区，则真空合格，如为紫红色，则不合格。生产能力检查：每年抽取一只冷冻干燥管，接种斜面、摇瓶，进行生产能力试验，如发现生产能力明显下降，则应进行分离复壮，挑选高产菌株重新制备冷冻干燥管。,冷冻干燥菌种管的质量检查,