结核病的研究进展.ppt
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1、结核病的研究进展,概 况,结核病是仅次于爱滋病的第二大感染性疾病。由于许多爱滋病死于结核,故在单一感染死因中,结核病仍居首位。自从在全球范围内开展DOTS以来,结核病的感染率、病死率及细菌耐药情况均有降低,但因各国具体实施状况存在很大差异,所以改善的速度十分缓慢,与预期目标相距甚远。对于全球结核病防治前景,许多专家并不表示乐观。,控制结核病的基本条件,及早发现,快速诊断和及时治疗 疾病发现率达到70%,有赖于广泛疾病普查治疗成功率85%,有赖于DOTS 这样结核病才能得到有效控制,每年递减率才能达到10%左右,如此高质量防治数十年后,结核发病率才会显著降低。,我国结核病疫情特点,感染人口基数大
2、,患病人数多,传染源多;发现率低,平均只有26%;DOTS覆盖率低;耐药患者多,WTO公布的耐药检测报告中,我国在特别警示国家和地区中名列第一;高危发病人群增多,如老年人群、糖尿病、AIDS等。,基础研究:Th1型/Th2细胞因子失衡,T细胞在结核病免疫中的关键作用:细胞免疫反应功能低下者是结核病的高危人群,而体液免疫功能低下者如多发性骨髓瘤,并不是结核病易感者。其中CD4+T细胞发挥了主导作用。Th1和Th2为两种功能不同的CD4+T细胞亚群,其分泌的细胞因子(CK)各不相同。,基础研究:Th1型/Th2细胞因子失衡,许多研究证实,结核免疫是由以灭菌为核心的保护性免疫反应和以组织坏死为特征的
3、免疫病理反应构成的,并由不同的结核抗原激发。保护性免疫反应是由保护性抗原活化的Th1细胞介导的巨噬细胞非特异性抗菌活性来完成的。Th1型CK主要有IFN,IL-12,lL-18D等。实验表明,敲出IL-12或IL-18基因,可使小鼠的结核杆菌的易感性明显增高;,基础研究:Th1型/Th2细胞因子失衡,由病原性抗原活化的Th2细胞则介导以TDTH细胞(迟发超敏反应性T细胞)为效应细胞的病理性免疫反应,并导致特征性组织坏死,Th2型CK主要有IL-4、IL-10、IL-13等。实验表明IL-10和IL-13均能抑制巨噬细胞杀灭结核杆菌的能力;小鼠敲除IL-10基因后可更快消除结核杆菌。,基础研究:
4、Th1型/Th2细胞因子失衡,据报道,机体感染结核杆菌后,Th1型CK反应超过Th2型CK反应达20倍时,可建立潜伏期感染,表明Th1型CK反应在抑制结核菌生长繁殖中发挥重要作用。临床实验表明,活动性肺结核患者外周血单个核细胞经结核抗原刺激后IFN-产生明显减少,IFN-基因无表达,而IL-10产生明显增加。但经两个月抗痨治疗后随着病情好转IL-12产量明显升高。,基础研究:Th1型/Th2细胞因子失衡,Condos等发现,涂片阴性非空洞性肺结核患者局部免疫反应以Th1优势为特征,BALF中IFN-分泌明显增高;而涂片阳性空洞性肺结核患者局部则以单核细胞和巨噬细胞为主,IFN-产生减少,但随着
5、抗痨治疗后临床症状改善,IFN-分泌细胞重新聚集到肺部。,基础研究:Th1型/Th2细胞因子失衡,由此可见:Th1型CK主要激活巨噬细胞,增强其杀菌能力,从而在结核感染中发挥保护性免疫作用。Th2型CK则抑制Th1型CK和IFN-的产生,降低巨噬细胞杀灭结核菌的能力,从而削弱结核免疫应答,与结核感染的进展、持续化和慢性化有关。,基础研究:Th1型/Th2细胞因子失衡,Th1型/Th2型CK的动态平衡是机体有效控制结核感染的根本保证,这种平衡一旦被打破,将导致结核病的发生和发展。,基础研究:结核杆菌基因组学,结核杆菌的全基因组测序工作已完成,共含441万个碱基对,约4000个基因,3924个开放
6、阅读框架。其中大部分用于编码脂类代谢酶;10%编码两类不相关的酸性蛋白,可能与产生抗原变异和逃逸免疫有关。约40%有功能,44%可能有功能,16%称为孤儿蛋白。,结核杆菌基因组学:耐药基因研究,在结核菌耐药基因研究中,近来发现:约90%95%的耐利福平菌株有rpoB基因突变;约47%58%耐药异烟肼菌株有katG基因突变,其余则inhA基因或ahpC基因突变;耐乙胺丁醇菌株与embA、embB基因突变有关;约72%耐吡嗪酰胺菌株与编码PZA酶的pncA基因突变有关。,基础研究:结核杆菌蛋白质组学,Jumy等对有毒结核菌株与无毒BCG进行比较蛋白质组学研究,发现有两种蛋白质仅在有毒菌株中高度表达
7、,菌种内变异非常小,有可能成为结核病早期诊断的分子标志。,基础研究:结核杆菌蛋白质组学,Bahk等采用比较蛋白质组学研究方法发现有两种蛋白质RRV369和RRV3874在结核杆菌中含量较高。然后采用联合酶联免疫吸附试验,对肺结核患者和健康人血清各100份进行检测,结果显示RRV369和RRV3874诊断肺结核的敏感性分别为74%和60%,特异性为97%和96%,有望成为肺结核早期诊断的分子标志物。,基础研究:结核杆菌蛋白质组学,Tuny等比对耐异烟肼菌株和敏感株的蛋白质组学差异,检测出了与异烟肼抗药性有关的蛋白。现在国际上已建立结核杆菌蛋白质组学跨国合作研究体系,计划在5年内阐明结核杆菌相关蛋
8、白的结构和功能,这将大大促进结核发病机制、抗痨治疗新靶点及新型疫苗的研究。,基础研究:细胞凋亡与结核病,结核病时巨噬细胞适度凋亡是一种免疫保护机制,可使结核杆菌丧失原有生存环境,导致细菌活力降低,也可清除炎症部位的感染细胞。吞噬结核杆菌的巨噬细胞发生凋亡后,细菌被包埋在凋亡小体内,又被循环单核细胞吞噬,这样可能会触发更为有效的细胞内杀菌机制。细胞凋亡还可抑制结核杆菌繁殖,防止结核感染播散。,基础研究:细胞凋亡与结核病,国外研究发现:线粒体膜结构的完整即线粒体渗透性转换(MPT)稳定,caspase激活降低和线粒体细胞色素C释放减少是巨噬细胞发生凋亡的标志,也是有效控制结核杆菌感染的特征。线粒体
9、膜完整性受损(MPT降低),caspase激活增加和线粒体细胞色素C释放增加是细胞坏死的表现,并造成无法控制的结核杆菌生长与繁殖。,基础研究:细胞凋亡与结核病,Hirsch等研究发现:活动性结核病患者CD4+和非CD4+T细胞自发凋亡以及结核杆菌诱导的凋亡发生率显著高于健康者,T细胞凋亡发生率与T细胞反应呈负相关,即凋亡率越高则IFN-、IL-2水平越低。经有效抗痨治疗后,自发的与结核杆菌诱导的凋亡发生率均下降50%,IFN-、IL-2水平升高38倍,这表明T细胞过度凋亡削弱了机体的抗结核免疫机制,与结核病发生和发展有关。,实验室诊断:病原学,抗酸染色和培养:痰涂片检出率(抗酸染色)约30%4
10、0%,痰中菌量必须多于5106/L才能检出;集菌法敏感性可达60%70%,与标本质量、检测者技术与责任心有关,但无法区分结核杆菌和非结核杆菌。国外报道,在痰标本中加入特殊荧光素作标记,可在荧光显微镜下进行区分。结核杆菌快速培养系统目前普遍采用MCIG和BACTEC,速度明显高于传统方法,平均9天可判定结果,缺点是放射污染率稍高。近来研制出一种快速变色培养基,敏感性与培养速度与之相当,且污染率低。,6,实验室诊断:病原学,噬菌体生物扩增法:分枝杆菌噬菌体是一种DNA病毒,只能感染相应的活分枝杆菌。噬菌体增殖周期速度快,在几分钟几十分钟不等,利用这些特性可用于结核杆菌的快速检测及药敏测定。,病原学
11、诊断:噬菌体生物扩增法,近些年来国内外对此法进行了大量研究,认为有以下优点:简便快速,操作简单,不含特殊仪器,检测标本仅需48小时可得到结果。灵敏特异,敏感度为200300条/毫升。安全可靠,该法将活体菌裂解杀灭,传染性小价廉,病原学诊断:噬菌体生物扩增法,但此种方法也存在很多问题:与某些非结核分枝杆菌有交叉反应。敏感度仍不够高,一般在7595%之间,且与痰菌含量有关,痰涂阳+为63.9%,+为71.97%,+为88.2%。操作影响因素多:需设立多种对照,以保证可靠性,且反应时间、温度、噬菌体活性含量及特异性、杀毒剂的浓度及混匀情况等均可影响检测结果。蛭弧菌感染:蛭弧菌是一种与噬菌体极其相似的
12、寄生微生物,可在活菌和死菌中增殖,裂解细菌后可产生菌斑,可造成假阳性,在操作中须避免污染。,病原学诊断:噬菌体生物扩增法,该法若要广泛用于临床,仍有大量工作必须完成:a.筛选出结核杆菌特异性高的噬菌体;b.试剂盒及检测方法的标准化。该法亦可用于结核杆菌药敏测定,但与常规药敏检测结果存在一定差异,须进一步研究明确其原因。近来美国学者构建了一种含荧光素酶基因的噬菌体,可用于多种一线抗结核药物的敏感性测定,并且一次可进行大量标本的检查,是迄今最快的药敏试验,今后须对该法进行标准化研究。,病原学:分子生物学诊断,PCR:PCR技术并不复杂,但要求标准化试剂盒,严格的技术质量控制和较高的实验条件。经过多
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