真菌感染与实验室诊断进展-李若瑜.ppt

《真菌感染与实验室诊断进展-李若瑜.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《真菌感染与实验室诊断进展-李若瑜.ppt（120页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、全国基层医疗机构抗菌药物合理应用,培训项目,常见病原真菌,李若瑜北京大学第一医院北京大学真菌和真菌病研究中心,真菌感染的分类,根据真菌侵犯人体的部位分为四类：浅表真菌病皮肤真菌病 皮下组织真菌病系统性真菌病,浅部真菌病,深部真菌病,临床常见的真菌病,浅表真菌病：花斑癣掌黑癣毛结节菌病,皮肤真菌病：皮肤癣菌病 手足、体股、头、甲皮肤念珠菌病,皮下真菌病：孢子丝菌病着色芽生菌病暗色丝孢霉病足菌肿,系统性真菌病：念珠菌病曲霉病隐球菌病接合菌病双相真菌感染,浅部真菌病,限于皮肤最外层，甲板、毛发和粘膜的感染。主要的感染是皮肤癣菌病和浅表念珠菌病。大多轻微，容易诊断，对治疗反应良好。,手、足、甲癣最常见

2、的真菌病,各种头癣：传染、危害健康,皮下真菌病往往经过外伤发病,孢子丝菌病,着色芽生菌病,系统性真菌病,常起源于肺，可以播散到全身许多器官。常通过吸入致病菌孢子而获得，其致病菌腐生于土壤或腐败有机物中，或作为植物致病菌。病原体可分为两组：真正的致病菌和条件致病菌。,系统性真菌病危及生命,系统性真菌病主要的致病真菌,荚膜组织胞浆菌粗球孢子菌皮炎芽生菌巴西副球孢子菌,临床常见的条件性真菌感染,念珠菌病:最常见，血源感染的第4位。曲霉菌病:常见于干细胞移植、实体器官移植、大剂量化疗患者。隐球菌病:艾滋病人患病率为10-20%。接合菌病（毛霉病）:多见于重症糖尿病、烧伤病及器官移植病人。,临床有增多趋

3、势的条件性真菌,非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染镰刀菌感染枝顶孢霉感染暗色真菌感染马尔尼菲青霉,真菌感染的诊断方法,真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学,真菌感染的实验诊断方法及问题,显微镜检查-阳性率？培养-时间？敏感性？意义？血清学-敏感性？特异性？分子生物学-标准化？,组织病理学,阿申蓝染色,H&E,PAS,组织学特点,Immunochemistry,皮肤隐球菌病的组织病理学,菌丝 孢子曲霉病的组织病理学,Prof.Richardd Calderones lecture-2006,Beijing,念珠菌病-直接镜检,隐球菌病直接镜检,曲霉病,曲霉头,曲霉病,双分支菌丝

4、,曲霉病直接镜检,双分支菌丝,曲霉头,接合菌（毛霉）病直接镜检,粗大无分隔菌丝,各种培养法,病原真菌鉴定的基本流程,临床标本,PDA,SDA28度培养,不能生长,鼻孢子菌、肺孢子菌、马拉色菌（厚皮除外）,芽孢,关节孢子,念珠菌、隐球菌、红酵母等,毛孢子菌、地霉等,有隔菌丝,无隔菌丝,担子菌、子囊菌、半知菌,接合菌等,常见病原真菌,酵母及酵母样真菌_念珠菌_隐球菌_毛孢子菌_马拉色菌,霉菌(丝状真菌)_皮肤癣菌_曲霉_毛霉_镰刀菌等,双相真菌,念 珠 菌 属,简介,念珠菌大约有150个种，65%以上不能在37生长，无致病性念珠菌属可以感染皮肤、粘膜及内脏器官引起念珠菌病常见的致病性念珠菌白念珠菌

5、、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌临床最常见的是白念珠菌,生物学特性,念珠菌在环境中和人体内均可寄生存在 正常人皮肤、口腔、肠道、肛门、阴道中可分离出本菌 显微镜下表现为芽孢和假菌丝假菌丝一般与致病相关寄生时一般表现为孢子相,致病性,条件致病菌 白念珠菌致病力强 念珠菌毒素、菌体形态、黏附性和分泌水解酶与其致病性密切相关,常见病原菌,白念珠菌（Candida albicans）热带念珠菌（C.tropicalis）克柔念珠菌（C.krusei）近平滑念珠菌（C.parapsilosis)光滑念珠菌(C.glabrata)乳酒念珠菌（C.kefyr）季也

6、蒙念珠菌（C.guilliermondii）,实验室检查,直接镜检：可见卵园形发芽孢子及菌丝，如查到大量假菌丝，说明念珠菌处于致病状态。染色：革兰氏染色，菌丝、芽孢呈蓝色，着色不均匀。过碘酸染色，菌丝、芽孢染成红色。用1:1000吖啶橙染色，在荧光显微镜下，菌体呈现荧光。培养：最常用的培养基是沙堡氏培基，当菌落生长后再移种至米粉吐温80培基或其它鉴定培养基中，以便进一步鉴定菌种。,念珠菌直接镜检（LPCB）,假菌丝和芽孢,致病性酵母菌鉴定原则,鉴定目的：确定感染及传染源；选择敏感抗真菌药物；哪些酵母菌需要鉴定到种：所有分离自无菌体液，包括脑脊液、血液、尿液、穿刺液及其它体液的酵母菌；分离自所有

7、严重疾患或免疫受损病人或怀疑真菌感染的病人的酵母菌；从任何临床标本中分离出大量的酵母菌；分自若干连续取材的标本，除呼吸道分泌物，也应鉴定至种的水平；,芽管试验（Germ-tube test）,原理：白念珠菌在有营养的液体环境中35培养，可从酵母细胞生出芽管。结果：白念珠菌可在2h内生成芽管，热带念珠菌和其他念珠菌则否。,厚膜孢子形成试验（Dalmo plate test）,念珠菌显色培养基CHROMagar Candida,API20C酵母鉴定系统,ID32C 酵母鉴定系统,VITEK全自动微生物鉴定仪,YBC酵母菌鉴定卡。有30个孔的一次性塑料卡，包括26个常规生化反应和4个阴性质控。利用Y

8、BC，只有21.3%的酵母需做补充生化试验或形态学检查。,白念珠菌,菌落特征 沙氏培养基25中等速度生长，形成酵母样菌落，奶油样、光滑、闪光，老后有皱褶显色琼脂基上呈绿色菌落 显微镜特征 玉米粉吐温琼脂：真菌丝和假菌丝，多数假菌丝，假菌丝连接处产生多数呈簇状、葡萄状小分生孢子，顶端或侧支产生厚壁孢子血清芽管试验，在371-3小时后，可以产生芽管,白念珠菌(Candida albicans),酵母菌鉴定程序和路线,酵母纯培养 玉米粉吐温琼脂培养基(25)假菌丝（+）假菌丝（-）厚壁孢子（+）厚壁孢子（-）尿素酶试验（+）尿素酶试验（-）白念珠菌 光滑念珠菌 关节孢子（+）关节孢子（-）酵母属 芽

9、孢（+）菌落无胡萝卜色 菌落呈胡萝卜色 芽孢（+）芽孢（-）念珠菌属 红酵母属 丝孢酵母属 地霉菌属 咖啡酸试验 有棕色色素 无棕色色素 新生隐球菌 隐球菌属,血清学试验-菌种鉴定,抗原型别：因子血清（CANDIDA CHECK）：九种因子+蔗糖分解，鉴别7种致病性念珠菌；因子血清（CRYPTO CHECK）：八种因子，可鉴别8种隐球菌及变种,分子生物学方法,1.5hrs,3hrs,2.5hrs,4.5hrs,5.5hrs,小结酵母菌鉴定依据,传统菌落颜色、外观镜下细胞形态、大小有无荚膜有无假菌丝和菌丝芽管形成和厚膜孢子形成碳源同化、发酵氮源同化、发酵,现代 辅酶Q系统 同功酶 血清学 基因分

10、型技术,敏感药物与耐药性,两性霉素B唑类抗真菌药物(除光滑和克柔念珠菌外,大多数对氟康唑敏感.长期用药有可能出现耐药)棘白菌素类药物,隐 球 菌,隐球菌属(Cryptococcus)特点,本属的共同特征为细胞呈圆形或卵圆形，偶有伸长形或多样形，呈多边芽殖。大部分菌株有荚膜。所有菌种都能同化肌醇并在碳源中生长。糖发酵（）在固体培养基中，大部分菌种呈粘液状，无假菌丝或假菌丝发育不全。不产生子囊孢子。冬孢子或掷孢子。新生隐球菌有性期：属担子菌，新生线黑粉菌,临床常见的隐球菌,Lodder1970年记载隐球菌：17种，6变种。主要致病菌种：新生隐球菌新生隐球菌新生变种新生隐球菌格替变种C.neofor

11、mans var.grubii浅黄隐球菌浅白隐球菌罗伦隐球菌,致病性隐球菌,新生隐球菌(C.neoformans)三个变种 新生隐球菌新生变种（C.neoformans var.neoformans）格特变种（C.neoformans var.gatii）C.neoformans var.grubii,血清学分类,A、B、C、D及AD型新生变种-D型grubii变种-A型格特变种-B、C型,致病性,呼吸道进入体内健康人具有免疫能力 易感因素AIDS、糖尿病、淋巴瘤、晚期肿瘤、SLE、器官移植,隐球菌病cryptococcosis,是由隐球菌属中某些种或变种引起的一种深部真菌病。主要侵犯中枢神经

12、系统,预后严重,死亡率高,也可侵犯肺部、皮肤、骨骼等其它脏器。近年来免疫力降低的病人逐年增多,本病发病率也呈上升趋势,特别是在爱滋病病人已成为死亡的主要原因之一。,生物学性状,在SDA培养基上25培养2-5天，可以见到奶油色酵母样菌落，有时黄色或带粉色显微镜下可见到球形或椭圆形酵母细胞，直径2-5m，第一代培养物有时可见小的荚膜，继代培养不见荚膜脑脊液直接涂片，细胞有较宽的荚膜。显微镜下有时可见到出芽现象,实验室检查-病原学检查,直接镜检:墨汁染色，新生隐球菌呈圆形或椭圆形的双层厚壁孢子,外有一层宽阔荚膜,边缘清楚完整,菌体内可见出芽（菌体计数：判断预后及疗效的指标）培养：培养基内可加氯霉素,

13、但不可加放线菌酮,因后者抑制本菌生长。生理生化测定：采用自动微生物系统和API鉴定组织病理学检查及免疫组化,直接镜检,脑脊液直接墨汁涂片,真菌培养,SDA培养基，25培养,实验室检查-其它检查方法,脑脊液检查：中枢神经系统隐球菌病脑脊液压力增高,外观正常或微混,白细胞数增多,早期以中性粒细胞为主,中后期以淋巴细胞为主。糖和氯化物在早期变化不明显,中后期可明显减少。蛋白含量在中后期增高。抗原检查：乳胶凝集试验检测脑脊液及其它体液标本中新生隐球菌荚膜多糖抗原可简便快速有效诊断隐球菌性脑膜炎,乳胶凝集试验,阴性,阳性,新生隐球菌(Cryptococcus neoformans),主要侵犯中枢神经系统

14、，也可侵及肺、骨、皮肤，甚至引起败血症。肺是新生隐球菌侵入的主要途径，肺隐球菌病也是隐球菌病的最早表现。该菌的特异性检查为，墨汁涂片，镜下可见圆形或卵圆形厚壁孢子，直径2.5-20um，单芽，也可多芽。菌体外围有一圈透光的荚膜，厚度几乎与菌体相等甚至大于菌体。孢子内有反光颗粒。尿素酶试验阳性。,新生隐球菌(Cryptococcus neoformans),直接镜检（墨汁染色）,咖啡酸琼脂产生棕色菌落,敏感药物,两性霉素B5-氟胞嘧啶(与两性霉素B联合用药)氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等唑类药物多用于维持治疗或两性霉素B不耐受的病例。,曲 霉,菌属分类,曲霉是一类丝状真菌，在自然界中广泛存在。曲霉

15、属的有性阶段属于子囊菌门、不整子囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科、散囊菌属、裸孢壳属和萨托菌属；有性期仅在部分曲霉有描述。无性阶段属半知菌、丝孢纲、丝孢目、从梗孢科。,菌属分类,烟曲霉（A.fumigatus）是最常见的致病曲霉其次为黄曲霉（A.flavus）和黑曲霉（A.niger）棒曲霉（A.clavatus）、灰绿曲霉（A.glaucus）、构巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、土曲霉（A.terreus）、焦曲霉（A.ustus）、杂色曲霉（A.versicolor）也有致病报道，但发生率低。,致病性,曲霉引起的人类疾病可分为3大类：机会性感染变态反应性曲霉病真菌中毒

16、免疫受损是曲霉机会性感染的最主要因素。,曲霉的菌落形态,曲霉菌落呈绒毛状或粉状。大多数曲霉的培养基背面无色或淡黄色。构巢曲霉培养基背面可以呈紫红色、橄榄色；杂色曲霉背面则可呈桔黄色、紫红色。,三种最常见人类致病性曲霉菌落形态,烟曲霉,黄曲霉,黑曲霉,曲霉的主要形态特征,菌丝-分隔、分枝、无色/淡色/深色足细胞-有分生孢子梗-分隔/不分隔,光滑/不光滑顶囊-烧瓶/半球产孢结构瓶梗/瓶梗+梗基分生孢子大小、颜色、纹饰其它:子囊果、菌核等,曲霉的特殊结构,曲霉的特殊结构包括：闭囊壳（cleistothecia）壳细胞（Hulle cells）粉孢子（aleuriconidia）菌核（scleroti

17、a）,烟曲霉,黄曲霉,黑曲霉,三种最常见人类致病性曲霉镜下形态,敏感药物与耐药性,可选用两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬净和米卡芬净。近年来，耐伊曲康唑的烟曲霉报道增多，而且出现多药耐药的烟曲霉临床分离株。对两性霉素B耐药的黄曲霉临床分离株也有报道。土曲霉对两性霉素B天然耐药。构巢曲霉对两性霉素B也常常耐药。,接合菌(Zygomycetes),生物学特性及致病性,接合菌的主要特征为无性型在孢子囊内形成不能游动的静孢子，有性型形成接合孢子接合菌纲中只有毛霉目和虫霉目两个目的部分种可以致病。由毛霉目的菌引起的病称毛霉病（Mucormycosis），毛霉目和虫霉目引起的病合称为接合菌病。,毛霉

18、目的分类位置,真菌界(fungus kingdom)接合菌门(zygomycota)接合菌纲(zygomycetes)毛霉目(mucorales)犁头霉属、根霉属、根 毛霉属、毛霉属,与医学关系,在毛霉目中已知可引起毛霉病有8科12属24种左右由毛霉目的菌引起的病称毛霉病，由毛霉目和虫霉目引起的病称接合菌病，亦称藻状菌病,毛霉病(mucormycosis)概述,是由毛霉目中某些菌种引起人类的一种感染性疾病,一般呈急性快速发展,少数为慢性发展。可累及鼻、脑、肺、胃肠道、皮肤等器官，其共同特征是血管壁破坏，血栓形成，周围组织梗塞，产生黑色坏死性损害。大部分病人有严重的基础疾病,如糖尿病、免疫抑制、

19、饥饿、烧伤或其它严重的外伤。,诊 断,较困难,特别是内部器官感染,常常是在尸检中发现。毛霉为空气的污染菌,血、尿、脑脊液中罕见病原体生长,血清学试验和直接ELISA 试验缺乏特异性,常规化验更无意义,因此诊断困难。直接镜检标本中和组织病理切片中见到宽大无分隔或极少分隔菌丝,比培养分离更有意义。真菌镜检阴性,不能除外诊断。糖尿病患者,有急性快速播散的鼻窦炎、眶组织蜂窝织炎、支气管炎、支气管或叶的肺炎,应考虑毛霉病的诊断。,组织病理,直接镜检,可见粗大的、无分隔的、不规则、宽约3-18um、分枝较少且呈直角的菌丝在HE染色清晰,PAS和GMS染色不良发现菌丝是诊断的基础,真菌培养,毛霉目中的致病菌

20、在许多真菌培养基上快速生长对放线菌酮敏感，故培养基内不用此药，可加抗生素抑制细菌生长。活体标本不要研磨以免损坏菌丝，而妨碍生长。置于2530培养，根据镜下特征鉴定菌种。用于毛霉鉴定的培养基主要是PDA和SMA（毛霉合成培养基）,毛霉的结构特征,治疗原则,积极控制基础病及早起初坏死组织及时应用两性霉素B或泊沙康唑还可选择伊曲康唑、特比萘芬,双相型真菌,Dimorphic fungi,双相型真菌,37 C 酵母相,27 C 菌丝相,定义,专指那些在组织内或37培养时呈酵母相，于室温中培养时则呈菌丝相的致病真菌包括申克孢子丝菌、马内菲青霉、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌和皮炎芽生菌等有较

21、严格的地域分布（仅申克孢子丝菌此点不突出）对人体致病力较强（有较大的侵袭性），患者不一定在感染前有免疫受损,马内菲青霉（Penicilium marneffei）,属于双相型真菌可引起马内菲青霉病（penicilliosis marneffei）主要流行区为东南亚，如泰国北部、越南、香港、台湾及中国的南方目前已成为HIV阳性患者的主要条件致病菌,菌落特征,在SDA上，25培养，生长快，初为白色膜样或绒状，逐渐变为黄色至黄绿色绒状，2周后呈灰绿色粉状，能产生可溶性酒红色色素，培养基呈红色在BHI上，37培养，呈脑回样皱褶的灰白色膜样酵母菌落，无色素产生,菌落特征,菌丝相,酵母相,显微镜特征-菌丝

22、相,帚状枝分散，双轮生，少数为单轮生，对称或不对称，有27个梗基，梗基上有36个瓶梗，顶端变窄，也可见单个瓶梗分生孢子呈椭圆形、球形，长而散乱，不成束,显微镜特征酵母相,可见关节孢子，圆形、椭圆形及两端钝圆有横隔的长形酵母细胞,荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）,属于双相型真菌有两个变种，即荚膜组织胞浆菌荚膜变种（H.capsulatum var.capsulatum）和荚膜组织胞浆菌杜波变种（H.capsulatum var.duboisii）可引起组织胞浆菌病(histoplasmosis)在北美和拉丁美洲的一些特定区域流行,显微镜特征,真菌感染的非培养诊断,非

23、培养诊断检测方法,G试验检测b-1,3 D-葡聚糖ELISA法检测曲霉抗原乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原ELISA法检测念珠菌抗原PCR_真菌通用引物、种属特异性引物,方法：G试验,-葡聚糖可特异性激活鲎（Limulus）变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。-b-1,3-D-葡聚糖通过激活G因子（Factor G）引起凝集；内毒素通过激活C因子（Factor C）引起凝集；试剂盒:祛除Factor C 葡聚糖特异,-1,3-D-葡聚糖 检测范围,不仅可检测念珠菌感染曲霉、镰刀菌 和很多霉菌均存在-1,3葡聚糖(Miyazaki,J Clin Micro 33:3115,95)

24、隐球菌细胞壁为alpha-葡聚糖,故为阴性阳性结果只能代表存在侵袭性真菌感染,不能确定种类假阳性:纱布，某些血液透析的滤过器等,Clin Infect Dis 2004;39:199-205,侵袭性真菌感染中葡聚糖检测,AML,MDSReceiving antifungal prophylaxis,Cut off60 pg/ml,Clin Infect Dis 2004;39:199-205.,30,30,with candidemia,control subjects,侵袭性真菌感染的葡聚糖检测Fungitell assay,检测曲霉半乳甘露聚糖抗原的 EIA 方法（Platelia）,检测

25、位于曲霉细胞壁上的 galactomannan,（GM）3.Detection avidin-enzyme+substrate2.Detecting Ab anti-galactomannan biotin conjugatedAg blood,urine,BAL1.Capture antibody monoclonal anti-galactomannan,Specificity=90%sensitivity=75%,Platelia Aspergillus EIA 结果判断,曲霉的GM 抗原检测,乳胶凝集试验（Pastorex）(15ng/ml)酶连免疫吸附试验（Platelia）(1ng

26、/ml),Sabetta et al.JID 1985;152:946Ansorg et al.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;13:582Verweij et al.JCM 1995;33:3150Maertens et al.Blood 2001;97:1604Herbrecht et al.J Clin Oncol 2002;20:1898,GM 抗原,GM抗原检测用于侵袭性曲霉病诊断,与临床诊断和疗效反应有良好的一致性。检测方法有ELISA、放射免疫分析（RIA）和乳胶凝集试验等。Platelia试剂盒采用ELISA方法，敏感性80%，特异性8

27、0%。儿童假阳性10%。Cut-off值影响结果0.5:早期诊断,特异性差;1.5:特异性提高。可动态观察。Dr.Maschmeyer G.in 2nd Trends in Medical Mycology,23-26 October 2005,Berlin,曲霉感染检测的影响因素,半乳甘露聚糖在血中存在时间短，建议：高危人群每周至少检测2次，动态观察 结合影象学、培养结果综合分析诊断,假阴性,假阳性,哌拉西林/他唑巴坦与其它细菌或真菌成分有交叉反应 肠道中定植的曲霉释放GM进入血液循环 含有谷物的食物中存在GM抗原，通过受损肠黏膜进入血循环导致抗原血症，化疗后出现严重黏膜炎的更易发生,检测真

28、菌DNA的PCR试验,标本：全血血清活检组织BALCSF,不同方法：DNA 提取 PCR 设计 产物检测,PCR,PCR技术用于诊断,种特异-PCR非特异 PCR杂交,Standart singlenestedPCR-EIAReal-time,标本全血血浆血清BAL,最低检测范围4-10 cfu/ml25-100 fg DNA,原位杂交,目的基因多拷贝基因,PCR过筛试验诊断IA,每周监测2次通用引物;确定采用巢式和实时定量;敏感性100%,特异性65%;早于临床症状2天,早于确诊9天;动态观察持续阴性可排除;,Dr.Maschmeyer G.in 2nd Trends in Medical

29、Mycology,23-26 October 2005,Berlin,Germany.,Jun Zhao et al.JCM 2001,Nested PCR in Animal Models,余进，等。中华检验医学杂志，2003,种特异引物巢式 PCR扩增烟曲霉rRNA基因,动物模型中巢式PCR方法检测的灵敏度,灵敏度=77.8%,余进，等。中华检验医学杂志，2003,突破方向,对基因组序列和功能的了解，找出特异处改进目前方法，提高敏感性Real-time PCR多重PCR芯片技术其它特异抗原,DNA 微阵列,芯片、探针:Candida spp.Aspergillus spp.临床标本:10-

30、20 cfu/ml body fluid PCR electrophoresis:75.6%DNA microarray:87.9%Zhu et al.AAA.San Francisco,9-12th September 2004,真菌非培养诊断小结,在诊断侵袭性真菌感染有一定价值，尤其早期诊断和疗效监测理想的检测方法很少隐球菌乳胶凝集曲霉ELISAGlucanPCR方法有待验证多次取材重要结合临床表现、真菌学等传统方法和影象学,122 patients 323 samples 33 proven cases,肺曲霉病诊断时间表,Kami M et al,Clin Infect Dis 2001;33:1504-12,真菌病诊断,感染病学家,真菌学家,生产研发者,联系方式:,6551122-3056,谢谢大家!,