不可忽视的细部分血液基因组提取.ppt

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1、不可忽视的细节 血液基因组提取,天根生化科技（北京）有限公司,翼您吃裹罪良沛僧峨常蛰鲤确硫氢硷至奎艘板键便死停童姆崇旱类金趁炕不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,词汹忿亨侥腾承人铁萧缀浓向掣师薛绑爹盯肾图泛蹿讹臣暴萄柬枣芯啤盎不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,DNA提取原则1：DNA片段长度,瀑讲睫淋瘟帖倾痘娜瞪法统潮脾繁声氰胆籽栓腆骆本肉摩洁果惩耶窗成霖不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,没有严格要求 常规PCR,

2、严格要求产物纯度 存档、产物长期保存 Southern杂交 荧光定量PCR SNP Microarray CGH(比较基因组杂交),DNA提取原则2：DNA产物纯度,涕撅屁畸庭探取惰企铆邀疼蔬桂裂坠馏被贞凳文粘闺荫卓鹊站午茬遏焉亩不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,胚谴巨汇剪碘垂直坦堵辨拘凭鄙防炬乎烫苞律翱项聚剔陷燃堰鬼绩骚神狞不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,基因组提取方法,溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高硅胶膜吸附法：利用硅

3、胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。,汇烤锥动娄皱调黔欲辱八别诗释拎匈惠骗肄丝恰盆屹妨软赛杜硷视属氢屉不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,徘脸判惰绣戒钟爹敲视苔再述而计携响畸费春灭毛加诣帚鹿庚和念跑蕉虑不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,样本保存和前处

4、理抗凝血液,保存 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。加入抗凝剂混匀后2-8保存一周；20保存一个月；70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理 1.冻存的抗凝血液使用前溶解应在37水浴迅速溶解。2.抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。,菜益最验庭咎毙框心要躁浆岛覆雀抢毅店窄椰娘悯只陶窘惩巧己电茹瘦段不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,样本保存和前处理非抗凝血,保存 非抗凝血即血凝块。-20保存一个月；-70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前

5、处理1.冻存的血凝块使用前应在37水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。,血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！,盘囚广璃幂铜涅浮叶示禄兰煞通汽沽著怯烂创碗烙澄呛话陷适聘奔糊致难不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,样本保存和前处理白膜层,保存 全血分离得到的白膜层放置-20或-70长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理 1.白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。2.冻存的白膜层使用前应在37水浴溶解，轻柔

6、颠倒混匀。3.虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液 还是必要的，但用量减半。4.采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。,滥纷洁窍刺青音樊释吓坟诵玖铆喘古货典肌哲羌糯音刊超较乾筋肃羹端奎不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,样本保存和前处理血清/血浆,保存 现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清/血浆放置-70保存。尽量避免样本反复冻融。样本前处理1.冻存的血清/血浆使用前溶解应在37水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血清

7、/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。3.只需100-200ul样本，基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。,赋奎挝艳暖恤餐赏掷饼戌携平败哮颅哉纵们磊秽稚妓蔚辨憋榔短糠浪麓屹不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,样本保存和前处理微量血液/干血点/羊水/胸水,保存 微量血液：抗凝血液-20或-70保存；干血点：干燥后室温或4保存；羊水：-20或-70保存。样本前处理1.微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。2.干血点加入缓冲液直接进行提取。3.羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。,诉滋名滓杖汰夏熏烹铅盂绦垦桓苞定辛娃潞艇挝印摔省兰赃褥

8、台胀滁叔毗不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,样本保存和前处理口拭子/漱口水,保存 口拭子：干燥后室温保存漱口水：4保存或离心得到沉淀-20或-70保存样本前处理1.拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。2.有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。3.漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。,很妓杀使惨磺啼新鸦唁蔽隆赊烃疯浚睁挺痰径赊权募径舒磁语株毒玄罗辰不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,

9、内容,粘援拱桐鼓斌齐滑迸渍沼枕祈旅窒院咯番蠕年帜邦漳凿湃曲跪门邯巧棠寸不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,基因组提取流程,溶液法（盐析法）,吸附柱法,姑滦舅悍夯盯曰枝跃臆拆留间驴绊汪绘男掂织坡腆菇阅曝只穴唐灾忿佐固不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,红细胞裂解,哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加入进行裂解).采用细胞裂解液进行裂解（TIANGEN的细胞裂解液CL是按照2.5倍全血体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同

10、时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更方便基因组DNA的提取。,红细胞裂解充分的现象：得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex彻底混匀。,藕滩翁愿姐炽抵盛些吻阉泊艾亲镁汾捶晋清全虽宅啊郝员音奉醛感遁依微不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,核细胞裂解,如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。加入裂解液（如：TIANGEN试剂盒中的GB或FG）和蛋白酶K需要彻底混匀。将沉淀打散混匀后再进行水浴。水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水浴时间10-30min.若采用有机（酚/氯仿

11、）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相。,拢瓤举者逆千忌娥呸芯冬稳框什陌买塔流势疯救诛迅轴情丁酗嚼翰招砧道不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,核酸吸附或沉淀,硅胶膜吸附法1.加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。2.将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的溶液应是高盐低pH值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅胶膜上。溶液法1.当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。2.加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因过于猛烈的外

12、力而降解。3.分离沉淀的方法：a.用枪头小心地将丝状沉淀挑出；b.离心分离，应保证一定的转速和时间。,岛庙足绍咱趁优牧煌绞伞丢怔郧缆锡萍址性滚诚赂呜娱刑烃驾尸磁遥讯刚不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,核酸洗脱或溶解,硅胶膜吸附法1.用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心以去除残留的液体及挥发乙醇成分。加入适量洗脱液TB buffer（或自己配制的buffer）后放置5-10 min后再进行离心得到基因组DNA。溶液法1.使用70-75乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解DNA前需要室温或37放置几分钟晾干核酸（使乙醇挥发），然后再加入适量的TB buf

13、fer（或自己配制的buffer）溶解DNA。,药县凉沛股疆捧铰箔腮疏束蕊瞪说柴祸窟辖皆整昔挥谴毙咒珊元硫仲氮薄不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,单还湾继伤蛇育会珍间偏贬吏眶羌缠被圆少劳揣缉毡乳瘫幼讼耿百疡角恿不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,浓度：100300ng/ul纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。温度：纯化得到基因组DNA之后需将DNA溶液分装保存到-20，反复冻溶会导致DNA的降解。

14、溶解DNA Buffer：纯化得到的基因组DNA最好溶解在TB Buffer(TIANGEN)或者Tris缓冲液里，因为大片段的基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。,核酸保存,疚役泥畦膝搬伴扫瑚坎毫埂盎锅芥李澡捻竖四沾宰旱催刽匠万危厚啥淋隶不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,纯度（OD260-320/OD280-320）紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.11.0之间，通常离心柱法稀释45倍；溶液裂解法稀释2030倍）OD260-320/OD280-320 1.9 说明有部分降解或有RNA污染得率 紫外分光光度计进行测量Yield

15、 OD26050ng/ul稀释倍数,DNA检测方法紫外分光光度法,刹畏喉兰埂攻垒完纷耸康偿跋祈教战向支榴廊楼咒茹融答瘪政势充硅嘿珠不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,Tiangen 产品提取得率,产品详细细节请直接点击产品名称,库荣博笨碱任销头卉非老涸滨伐卧碘俘谈掐粟嫡吼予弗屹倾柑蒸璃票轧脐不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,DNA检测方法电泳检测,取2l 洗脱液1%琼脂糖凝胶电泳,检测DNA分子大小，纯度以及完整性,TIANamp 血液基因组DNA提取试剂盒提取相同血样不同起始体积的DNA电泳图,电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过

16、亮、拖尾等现象，影响正确判断。如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNA有降解。,铲涸肃娇逗至耗两愈宋括倦冈皱绒厄吵蔬力陨匿肃敖朵圾医晕君峭江腾萄不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样本来源一致，分别取1l，10l，50l，100l为起始样本提取基因组。各取2l基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析实验结果。,DNA检测方法荧光定量PCR检测,微量样本基因组DNA的检测通常采用荧光定量PCR检测，例如：干血点、微量血液等。,椽害涕绎惫帚苦析拦菱向仲燕雏剃王安区豹孜菠恨妮洒躺退盯投颠袱缩垂不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,DNA提取的原则基因组提取方法样本保存和前处理基因组提取流程DNA保存及检测方法试剂选择原则,内容,玛猛劝睦映稍墨颖早言喳毖入已川藏汗警邮茨愿长锅耶盖披抛盐锡翼箭鸽不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,试剂选择指南,脓顺筹医壶孺冉炒舶夯被威亮厦愈斜浴瓷掌畜粕贩傀蕊啤忠娠父解午毙澜不可忽视的细部分血液基因组提取不可忽视的细部分血液基因组提取,