植物组织培养技术.ppt

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1、植物组织培养技术,A Glimpse of Plant Tissue Culture,主要内容：,概述,植物组织培养含义,组织培养的类型,植物组织培养的发展简史,植物组织培养在农业上的应用,本节教学目的与要求,(1)掌握组织培养的概念和类型；(2)掌握组织培养的特点；(3)了解组织培养发展史；(4)初步掌握组织培养在农业实践上的应用。,一、什么是植物组织培养What Is Tissue Culture?Or in vitro culture?Or micropropagation?,（一）概念：,器官（organ)：根、茎、叶、花、果实、种子,组织（tissue)：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层

2、等,植物组织培养（Tissue culture）是指用无菌方法使植物体的离体（in vitro)器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（In vitro culture）或试管培养。,Characteristics of Plant Tissue Culture Techniques,培养条件可以人为控制,生长周期短，繁殖率高,植物组织培养特点,管理方便，利于工厂化生产和自动化控制,（二）植物组织培养的理论基础细胞全能性,1、细胞全能性（cell totipotency)：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有

3、发育成完整植物体的潜在能力。,2、植物细胞全能性的表达,脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。,一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。,再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。,脱分化,愈伤组织,再分化,根芽,再生植株,3、植物组织培养过程,合适的外植体离体的植物器官、组织、细胞,移栽,外植体（explan

4、t)：由活体（in vivo)植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。即能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段。,胡萝卜离体根,愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。指经细胞与组织培养产生的可传代的未分化细胞。,4、组织培养植株再生的途径,魔芋胚状体,1）、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径）：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。,胚状体发生途径,外植体,脱分化,愈伤组织,胚

5、状体,再生植株,再分化,2）、器官发生途径：由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。,百合鳞叶培养,外植体器官发生途径,愈伤组织,芽分化,再生苗,胚状体,小麦,愈伤组织器官发生途径,外植体,愈伤组织,芽,根,再生植株,脱分化,再分化,高生长素(1,2-D),高(生长素/细胞分裂素),低(生长素/细胞分裂素),器官发生途径,愈伤组织,按培养材料分为（Gamborg等)：,愈伤组织培养器 官 培 养细 胞 培 养原生质体培养,最为常见的组织培养,悬浮细胞培养单细胞培养,胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养,（三）、植物组织培养的类型,根据培养器官的不同

6、：叶培养、根培养、花药培养、胚珠培养、茎尖培养等,烟草,（三）、植物组织培养的类型,根据培养方式：固体培养、液体培养 固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体震荡培养。,（三）、植物组织培养的类型,固体培养,液体培养,(1)固体培养法 是最常用的方法。该方法简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。(2)液体培养法 由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给 往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-200rmin，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又

7、能保证氧气的供给。,固体培养、液体培养的特点：,根据培养物量的多少：大量培养、微量培养。根据培养过程中是否需光：光培养、暗培养根据培养方法的不同：平板培养、微室培养、悬浮培养等,（三）、植物组织培养的类型,按培养过程分为:初代培养和继代培养,初代培养（Primary culture）：指外植体的最初培养。继代培养（Subculture）：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。,（三）、植物组织培养的类型,二、植物组织培养发展简史,1、萌芽阶段：(从20世纪初到30年代中）,1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，

8、奠定了组织培养的理论基础。1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出植物细胞全能性（totipotency）理论。1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。克服其种子发芽困难的问题1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种,玉米成熟胚的培养,Haberlandt：,观点：,贡献：,提出细胞全能性,首次进行离体细胞培养,高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞,1934年，美国植物生理学家White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。,2、奠基

9、阶段（从20世纪30年代末到50年代中）,1934年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus,1937年：White发现3种B族维生素和IAA对植物生长有用,1939年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功,1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功,1939年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功,组织培养的奠基人,3、快速发展和应用阶段（从20世纪50年代末至今）,1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株。这是第一次实现人工体细胞胚，是植物组织培养的第一个突

10、破。1960年英国学者Cocking用酶法分离原生质体成功。这是植物组织培养的第二个突破。1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。,三、应用领域,1、快速繁殖,2、种苗脱毒,3、远缘杂交,8、植物性药物和生物制品的生产,7、基因工程,6、种质保存,4、突变育种,5、单倍体育种,四、植物组织培养在技术上的发展,研究材料范围逐步扩大培养

11、方法逐步完善培养基不断改进实验手段逐步完备,植物再生植株的途径,小结：,(1)植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。(2)类型：按照外植体的不同，分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。(3)组织培养特点：培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而发展迅速。(4)组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。,植物组织培养实验室 构建及操作技术,植物组织培养学,本节教学目的与要求：,(1)掌握

12、组织培养实验室的设计；(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。(4)掌握灭菌和消毒的区别；(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；,商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 培养基及其配制 外植体的选择与培养 试管苗的驯化与移栽,本节主要内容,1、培养器皿的清洗；2、培养基的配制、分装和高压灭菌；3、无菌操作材料的表面灭菌和接种；4、将培养物放到培养室培养；5、试管苗的驯化、移栽和初期管理。,一 商业性组织培养实验室和小工厂的 设计与主要设备,一般组织培养的操作工序：,一、设计：,二、仪器设备和器皿用具,1、超净工作台或接种箱2、空调3、除湿

13、机或加湿器4、恒温培养箱5、高压灭菌锅6、冰箱7、天平8、显微镜9、水浴锅10、摇床与转床11、蒸馏水发生器12、酸度计13、离心机,（一）常见仪器设备,组织培养实验室的 设计与主要设备,1、培养器皿：试管、三角瓶、培养皿、圆形培养瓶、果酱瓶2、分注器3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器6、实验器皿：量筒、烧杯、容量瓶、试剂瓶、塑料瓶、酒精灯等。,组织培养实验室的 设计与主要设备,（二）各类玻璃器皿,1、镊子：尖头镊子、枪形镊子2、剪子3、解剖刀4、接种针5、钻孔器,组织培养实验室的 设计与主要设备,（三）器械用具,二 培养基及其配制,本节目的要求：(1)一般掌握培养基的种类、特点；(2)掌

14、握基本培养基的配方；(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；(5)熟练掌握培养基的灭菌方法；(6)一般掌握培养基的筛选办法。,一、培养基的成分,培养基及其配制,1、无机营养元素(inorganic element),1)大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素。N、P、K、Mg、S和Ca等。,2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。,培养基及其配制,2、有机化合物(organic pound),最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。使用浓度在1%5%，常用3%作用：碳源；维持培养基渗透压。,（1

15、）碳水化合物,培养基及其配制,在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。种类：VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、VH(生物素)、VB11(叶酸)、VB12（钴胺素)等。使用浓度：一般用量为0.11.0mgL。,（2）维生素(vitamin),培养基及其配制,又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度：一般为lOOmgL，作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,（3）肌醇,培养基及其配制,作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。种类：最常用的是甘氨

16、酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用浓度：为10200mgL。,（4）氨基酸(almino acide）,培养基及其配制,3、有机附加物（天然复合物）,10%20%,150-200mlL,150200gL,0.01%-0.05%,浓度：,培养基及其配制,4、植物生长调节物质(hormone),赤霉素（gibberellic acid）,细胞分裂素类(cytokinin),生长素类(auxin),培养基及其配制,*作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-510-8mgL)

17、就可促进生长，其次是茎和芽。,（1）生长素类,培养基及其配制,吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid）萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyri acid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D(2,4-dichlorophenoxybutyric acid),*生长素种类：,培养基及其配制,IAA(吲哚乙酸),NAA(萘乙酸),IBA(吲哚丁酸),2,4D(2,4二氯苯氧乙酸),生长素作用强弱顺序：,强,弱,培养基及其配制,种类：6BA(6苄基腺嘌呤)Kt(kinetin 激动素)Zt(zeatin 玉米素),（2）细胞分裂

18、素类,细胞分裂素作用：促进细胞分裂与扩大。诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。抑制根的分化。,培养基及其配制,Kt(激动素),6BA(6苄基腺嘌呤),Zt(玉米素),细胞分裂素作用强弱顺序,强,弱,培养基及其配制,GA3（赤霉酸）：作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。,（3）赤霉素,培养基及其配制,5、培养材料的支持物-琼脂(agar),固体培养时最好的固化剂。用量：610gL。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中

19、，成为溶胶，冷却至40 即凝固为固体状凝胶。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,培养基及其配制,固体培养基的特点（与液体培养基相比）:,优点:操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。,固体培养,液体培养,培养基及其配制,6、抗生物质(antibiotic),种类：青霉素、

20、链霉素、庆大霉素等。浓度：520mg/L。作用：可防止菌类污染。,培养基及其配制,7、活性炭(active carbon),目的：是利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响；利于生根。使用浓度：15gL。它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。,培养基及其配制,8、水（water),作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。,培养基及其配制,二、培养基的PH值(pH value),1、多数植物要求2、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N

21、的HCI调节.3、注意：经高压灭菌后，培养基pH会下降0.2-0.8,固调整pH值时,应高于0.5；pH的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH6.0时，培养基将会变硬，pH 5.0时，琼脂凝固不好。,培养基及其配制,培养基及其配制,不同植物对培养基最适pH值的要求不同(见表),培养基(culture medium)：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,三、培养基的种类、配方及特点

22、,培养基及其配制,1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基,2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基,3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基,4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、改良培养基。,（一）培养基的种类,培养基及其配制,若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为基本培养基。在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全培养基。,初代培养基：指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基：指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。,培养基及其配制,（二）MS培养基配方,培养基及其配制,1、MS培养基：它是1962年由Mura

23、shige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。特点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的N、K，硝酸盐量大，营养丰富。,（三）常用的培养基及特点,培养基及其配制,2、White培养基：1943年由White为培养番茄根尖而设计的。特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。,3、N6培养基：1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。特点：是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养。,培养基及其配制,(4)B5培养基:是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。特点：是含有较低的铵盐，较

24、高的硝酸盐和盐酸硫胺素。,(5)KM8P培养基:它是1974年为原生质体培养而设计的。特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。,培养基及其配制,四、培养基的配制,（一）、母液(stock solution)的配制和保存所谓母液是欲配制液的浓缩液。意义:保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取 便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。,培养基及其配制,单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用mg/ml 或mg/L表示。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混

25、合成母液。配制生长素类：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。浓度为：1-5mgml。配制细胞分裂素类：一般先用少量0.5-1N盐酸加热溶解。浓度为：1-5mgml。,培养基及其配制,母液的配制方法：,培养基母液的配制,培养基及其配制,（二）培养基的配制及其灭菌,1.配制方法：1、将母液按顺序摆放2、取适量的蒸馏水(所需培养基量的2/3)入容器3、按需要量依次取母液及生长调节物质4、加入蔗糖(30g/L)溶解5、加琼脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min5、定容6、调PH值(pH=5.8)7、分装培养瓶，封口8、高压灭菌,培养基及其配制,组织培养常见的灭菌方法,消毒:是指杀死、消除或

26、充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。,灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。,培养基及其配制,常用的灭菌方法,物理方法,化学方法,干热灭菌(烘烧和灼烧),湿热灭菌(常压或高压蒸煮),射线处理(紫外线、超声波、微波),过滤除菌,大量无菌水冲洗,升汞(氯化汞),甲醛(福尔马林),过氧化氢,高锰酸钾,来苏儿,漂白粉,次氯酸钠,酒精,培养基及其配制,2.培养基的灭菌湿热灭菌法,培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108kP

27、a的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,培养基及其配制,将锅内空气完全排除后，关闭放气阀。当压力表上升达108kPa时，锅内温度达121（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持20-30min。,培养基及其配制,灭菌方法：,过滤灭(除)菌（不耐热的物质）,一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维生素是不耐热的，常用过滤灭菌-细菌过滤器方法。防细菌滤膜网孔的直径为0.45m以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。,培养基及其配制,空间及物体表面灭菌,培养基及其配制,熏蒸剂:甲醛和高锰酸钾。,(1)紫外线灭菌,(2)熏蒸灭菌,2

28、.培养基的灭菌湿热灭菌法,培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108kPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,培养基及其配制,第四节 植物抗病细胞突变体筛选,抗病细胞突变体基本原理抗病细胞突变体筛选程序抗病细胞突变体筛选实例,本节主要内容,基本原理,植物抗病细胞突变体筛选,利用植物组织培养过程中出现的变异，或由物理、化学因素诱发变异，给予一定的选择压力，筛选出符合育种目标的无性系。,基本程序,植物抗病细胞突变体筛选,选择压力,选择突

29、变体,分离突变体,鉴定突变体,愈伤组织细胞原生质体,保持和利用突变体,愈伤组织：最简单的细胞材料，缺点多，普遍采用。细胞培养物：由少数细胞集合而成，可弥补愈伤组织的不足。原生质体：最理想的细胞材料，但分离和培养技术不完善，不能普遍采用。,植物抗病细胞突变体筛选,材料选择,负选择法：选择一种培养基，使得突变细胞不能生长，野生型细胞生长。然后加负选择剂，可杀死生长分裂细胞，保留不能生长的突变细胞。正选择法：将细胞置于有害或有毒的培养基中，能生长的为突变细胞。,植物抗病细胞突变体筛选,突变体的分离,突变体的4个特征：突变体以低频率发生 离开选择压，突变体稳定 植株再生后，突变细胞系稳定，从再生植株发

30、生的愈伤组织，表达其被选择出的表现型 选择出的表现型能通过有性传递保证它是突变的。,植物抗病细胞突变体筛选,突变体的鉴定,储藏再生植株种子 突变细胞系再生成植株，取其茎尖无菌无性系 不能再生植株细胞系与液氮中低温储藏,植物抗病细胞突变体筛选,突变体的保存,抗病虫细胞工程育种,(1)概念和类型；(2)抗病虫花培单倍体育种；(3)抗病虫体细胞杂交育种；,（一）概念：,无性系变异离体筛选,花药或花粉离体培养,抗病虫细胞工程育种 是指用细胞工程技术有目的地改造植物的抗性，以获得抗病虫的新品种或新物种。三条途径：,抗病虫细胞工程育种,体细胞杂交引入抗病虫性状,定义：指通过花药或花粉离体培养再生单倍体植株

31、，然后经过染色体加倍和常规选育获得抗病虫植物品种的育种方法。,抗病虫细胞工程育种,抗病虫花培单倍体育种,育种程序,1.选择亲本进行有性杂交,2.取杂交后代的花药或花粉培养，获得各种类型的单倍体植株,3.染色体加倍，得到纯合二倍体株系,4.鉴定抗病虫的优良品系,5.通过区试和品种审定，得到抗病虫的优良品种,抗病虫细胞工程育种,外植体的选择与预处理,材料的表面消毒,花药培养的一般步骤,接种和预培养,培养与植株再生,生根壮苗与移栽,花蕾或幼穗，保湿，低温处理,预培养可提高花粉植株的诱导率,花粉植株倍性鉴定与染色体加倍,倍性鉴定：取花粉植株的茎尖或根尖组织，制成临时装片，在显微镜下对细胞进行染色体计数。加倍：0.02%0.4%秋水仙碱处理。,抗病虫细胞工程育种,定义：利用植物体细胞杂交技术并结合常规育种培育出抗病虫品种的育种方法。植物体细胞杂交：指将植物不同种、属或科间的体细胞原生质体通过人工方法诱导融合形成杂种细胞，然后进行离体培养使其再生成植株的技术。,抗病虫细胞工程育种,抗病虫体细胞杂交育种,育种程序,1.选择亲本进行体细胞杂交,2.原生质体的制备,3.原生质体融合,4.杂种细胞的筛选与鉴定,5.杂种细胞的培养与植株再生,抗病虫细胞工程育种,5.结合常规育种培育出抗病虫品种,