艾滋病抗体检测技术422.ppt
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1、HIV抗体筛查方法,疾病预防控制中心2009年,窑汗畦个涝滦吼屁帜萤踩身缄蓝卢贯往哆绿血亏鹿覆浅短汛愉词渴臻君两艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,HIV在病毒分类中属逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。迄今为止,根据血清学反应和病毒核酸序列测定,全球流行的HIV可分为2型:HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1型内,根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性又进一步分为3个组:组(主要组)、组(外围组)和组(新组或非M非O组),组内又可分为-10个亚型。在HIV-1型和HIV-2型之间,其核苷酸序列有45-5
2、0%的同源性,并且存在免疫交叉反应。应用免疫印迹法(West blot)可以将二者明确地区别开来。,馁凌悄剩氖标溜慢皇适仙牙峨幅溶专碰坤淘颜浴辨采染博獭辑博溪请蜂莉艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,HIV-1和HIV-2型虽然都起源于非洲,但HIV不同型,不同组甚至不同亚型在全球流行是不均一的。HIV-1的O组,N组和HIV-2型只局限在非洲某些局部地区流行。而HIV-1的M组病毒呈全球性流行。到目前为止,全球流行的绝大多数毒株是HIV-1M组中的A、C亚型毒株,接着是B亚型毒株,然后是A/E和A/G亚型重组毒株。进一步的分子流行病调查表明
3、,在非洲几乎流行了HIV的所有亚型,但以A和C 亚型为主,同时,也正由于众多亚型的共流行,那里也是发生病毒重组最多的地方。在北美、欧洲和澳大利亚,B亚型仍然是最常见的亚型,虽然M组的其它几个亚型、甚至O组病毒已经在美国和欧洲几个国家有报道,但进一步的现场流行病学调查证实,这些人中的大多数是来自非洲的移民。在南美,B亚型占有优势,但C、F亚型也有流行。在阿根廷和巴西有B/F重组毒株的报道。在亚洲,好几种不同的HIV-1亚型流行于不同区域,在印度C亚型占主导,同时有A、B 亚型共流行和A/C亚型重组毒株的报道。在泰国则有二种独立的亚型流行,B亚型和E亚型(即A/E亚型重组毒株)。在我国主要以B、C
4、和E亚型流行,但同时也A、F和HIV-2型的报道。,孜歪拌栽沽够隐硷话剔罢谢瞎菲需牲寅磁镜刊夕烛鸽背婆砂偶荷颂早茄臀艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,HIV病毒侵入人体后,其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合,吸附到宿主细胞上;gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用,使病毒与宿主细胞膜更接近;gp41产生一系列构象变化,其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜,导致病毒包膜与细胞膜的最终融合,病毒RNA进入细胞。在HIV感染后,最先能够监测到病毒RNA、然后是p24抗原,最后是抗体。,本隧涟贴孙尔踞榜狗躲觅芒缔螺巫嵌警册
5、哼青驰搂互约无似凉笆燕书台珐艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,在感染后的1014 d内,病毒RNA水平是呈指数上升,随后下降并保持在持续稳定的水平上,进入HIV无症状期p24抗原水平随着病毒RNA水平的发展而发展,在急性感染期就可以出现,被认为是病毒复制的间接标志,但由于检测方法的灵敏度不够而使得其检出时间要比RNA晚。,满挂廊荤泉砰卡烘肤右札吻依嘿榨砍潜猾法榆悬慷羌题疡燃阳滞奉狮哆姓艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV的感染机制简述,窗口期概念:从HIV感染到能够检测出HIV抗体这一时期,被称作“窗口期
6、”。在窗口期,只有通过病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴细胞水平来确定HIV感染。CD4淋巴细胞水平随着感染的发展而逐渐下降,当其在血液中细胞下降到200个/mm3时,就会发生严重的免疫缺陷,患者就被确诊为艾滋病。病毒RNA、p24抗原、HIV抗体和CD4淋巴细胞水平可以用来确定HIV感染、检测病情发展。,汤兜习奴追贴且兄芍惟俩俱疙悦理卯讹墓次舆枷甲贰舆矮仑愉窜痔作翰贪艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV感染的主要检测方法,目前检测HIV的方法有100多种,总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体,间
7、接地诊断HIV感染。病毒检测包括p24抗原检测、细胞培养(病毒分离)和病毒核酸检测。抗原能够在个体感染后先于血清转化218 d被检测到。因此,在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势,可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。,握午霸庐湿嚣想诺崭郊觉核腆晦明垃袭雄巩赏式噪毡也臻薄讶序伎碑红社艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV感染的主要检测方法,病毒培养是检测HIV感染最精确的方法。一般采取培养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断。在窗口期可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量,具有很高
8、的灵敏度,使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术,能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断,如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。近几年,分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中,HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展,核酸检测已经成为了HIV实验室诊断的发展方向。,宿盾遵诅润搔咨挠豹体忧荒靳荐葱葛时椿钡福细利湘羽邢疮橱液鹃护千霜艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,HIV感染的主
9、要检测方法,抗体通常是在感染后38周能够被检测出来,在窗口期,病毒抗体不能被检出。抗体检测由初筛和确认试验组成,目前,大多应用双抗原夹心法进行抗体筛查,这种方法具有很好的灵敏性和特异性。酶联免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的灵敏度,且操作简单、快速,适合对大量样品的检测,是目前临床通用的初筛检测方法,初筛试验呈阳性的必须进行确认试验。确证试验国际上有3种确认试验方法,包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验,目前以免疫印迹试验最为常用。,孰宽降捻俞折熬荣碧驰喀午硷愿员铃平箭建呢谆浩锥害垛撰枝腾鞭难脊渝艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体
10、、抗原检测方法,HIV抗体一般在人感染后数周逐渐出现,可延续至终生,95%在三个月可以检测出抗体。血清学试验分为初筛和确认试验。常规实验方法:酶联免疫吸附试验、免疫印迹试验(WestBlot)、间接免疫荧光法(IFA)。快速检测方法:明胶颗粒凝集试验、斑点免疫结合试验、24抗原的检测。最常用的初筛试验和确认试验分别是酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验(WB)。,钩测摆蝴中嫂下桅岂车肪窝轻肘驱诲酪峨分闭粒锻累朽邮炙粪砒劣纯收奎艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,常用HIV病原学检测方法:病毒分离抗原检测-24抗原的检测核酸检测(cDN
11、A测定-PCR、RNA测定-病毒载量)其他方法:逆转录酶测定、原位杂交常用HIV抗体检测方法:ELISA 快速HIV检测(RT)免疫印记法(Western Blot)其他方法:免疫荧光法(IFA)、放射免疫沉淀,郭鹊删亲氏闰登酮桶营硬溪第屹绊症撩崖零适搏往莎既罩庇珐弗缎常慢骑艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,酶联免疫吸附试验:ELISA法的基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物,酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观
12、察结果。分类:双抗原夹心法测抗体、双抗体夹心法测抗原、间接法测抗体、竞争法、捕获包被法等由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。,个撕耕隐醒席都滁液协鳖棋状巨洛郁杀盒赵鸣弃兽优席镰僚胃张菌积鹊浓艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,ELISA的结果判断:实验是否成立判断:阴性对照(NC)和阳性对照(PC1,PC2)的要求条件Cut off值的确定灰区概念:把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念,即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑,需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性,如仍落在灰区范围
13、内则报告阳性,灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。高值钩镰效应(HD-HOOK):在二位点夹心ELISA中,其剂量反应曲线的高剂量(HIGHDOSE,HD)区段,线性走向不是呈平台状无限后延,而是向下弯曲状。产生该现象的分子机理有分子变构说和浓度效应等推论。一步法和二步法均存在,只是前者出现的更早些,大多数是高值低吸光度,很少阴性结果。报告:对HIV抗体筛查试验,呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告,对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告,可出具“HIV抗体待复查”报告.,羊矣鞍孕块秀澄微左歼晋湃缘琼遇瞄乙公陋煌垣甜捣拒炙艺材启绞呻偏韧艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2
14、009422,ELISA实验的影响因素,试剂的质量-选择质量优良的检测试剂,严格按照试剂说明书进行操作,操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。选择灵敏度高,特异性好的试剂。不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别,影响灵敏度因素:试剂平衡30分钟:试剂没有平衡或平衡时间太短会造成试剂混匀不够,样品孵育时间相对缩短,ELISA反应不够充分,灵敏度明显偏低。冬季室温低,可将试剂盒置37温箱20分钟。试剂存放:试剂在室温放置24小时后灵敏度开始下降,放置时间越长、室温温度越高灵敏度下降越明显;实验过程中任何一步缩短时间灵敏度都明显下降,如果同时缩短每一步反应时间灵敏度下降更显著超过有效期的试
15、剂灵敏度明显下降,超过时间越长下降越明显。,侥噬箔身缉激挑枪稼荤纽缮智祝证摸鳃零刽肉车躲或琴革够深藕头螺蒂一艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,标本质量:最好将血液先自然存放1-2小时后,再用3000rmp离心15分钟;标本为血浆:必须使用含抗凝剂的血液标本收集管,采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次,放置一段时间后,3000rpm离心15分钟;若在几天内检测,可放在2-8冰箱中,若要贮存,则置于-20的低温冰箱内。干扰物质的影响,大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果;常见的干扰物质有:类风湿因子、补体
16、、交叉反应物质和其他物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性,高浓度的AFP(如孕妇),在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质(红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素),在洗涤过程中往往难以完全洗脱,会释放出原生态氧(O),从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质,即显蓝色,产生假阳性。,瓤羚刘鄙百丝峪订衅协洗娟辣筑龙仆爵锄榴犊许海刀宽趁焰箱闷州胶栅唉艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,标本质量:因菌体中可能含有内源性辣根过
17、氧化物酶,因此,被细菌污染的标本同溶血标本一样,亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。在冰箱中保存过久的标本,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性;为克服上述干扰,ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集;如不能立即测定,5 d内测定的血清标本可存放于4,1周后测定的血清标本应低温冻存;冻存后融解的标本,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混合后再测定,但混匀时应轻柔,不可强烈振荡。塑料试管能吸附抗原物质,样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性最好使用真空采血管;并使用非抗凝标本,肝素抗凝血浆会增加OD值,EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活有
18、时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。,贝筑汛竖刮近樟杀袭驭错溯泪诅聂胯械柱慌拄挑镁垦沦鞍秒碟斩沤钱格谅艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,加样:加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡。加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区,易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。所以,有时候一份标本用相同的试
19、剂盒这次测定为阳性,下次测定为阴性,往往就是上述加样及试剂的错误所致。手工操作中,加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时);全自动酶标仪也存在同样的问题,孵浴时间差距较大。标本较多时,请分批操作。吸量不准确,直接影响检测结果。因此加样器也要经常清洗,定期校准。加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。加样的顺序,持朵库悠发蕉矫后概狭蕾神烘傈项笋镰割剧咕憨全蠕园变疹畅窒战淋击锹艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,孵浴:温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求,酶标板周围与内
20、部孔升降温速率不同,造成周边与内部孔结果差异;干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,并要求固相板放入水中,减少受热不均,贴密封膜,防止污物浸入和水分蒸发。孵育时未贴封片或加盖,使标本或稀释液蒸发,吸附于孔壁,难于清洗彻底;孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底。,轿铣瞪耐锻尘孜拐迅炸玉下跺应假绷酶苇浙佰诽寿拜纳掺希紫挛躺叭磐墩艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,洗板:是ELISA操作的重要环节,手洗条件一致性较差,对结果影响较大,全自动洗板机使用不当也会影响结果,血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使
21、洗板机针小孔处于阻塞状态,造成未结合标记酶洗脱不彻底,抽吸不完全;洗板不畅,导致洗板效果差。导致“花板”造成假阳性或假阴性;洗液量不足,保证洗液注满各孔。采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。采用半自动洗板机洗板时,洗液量不足,导致洗板不彻底;反应板过多造成洗板等待时间长。及时更换吸水纸,尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去,否则可能影响试验结果。,伶绣瞳森咕由繁揭杆灼孝军匣列速蹭华泛虚塌恨厢龋灰诚俯苗吻筐仗爽淋艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,显色:一般来说,显色时间过短,结果偏低;显色时间过长,空白增高或者非特异性显色增加。显色剂配制后
22、放置时间过长或使用过期显色剂;尤其是国产试剂。尽量临用时配置。坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用;加显色剂时溅出孔外造成液体回流。终止:加终止液时产生较多气泡,导致假阳性增加。,贡氮拽淌韦动灌介遵莱魁乖介狱讯划腐了映拧翔际琴蜂谋玛谈垢肇味锋扔艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验的影响因素,读板:单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定;而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次,敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特
23、异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和;非敏感波长下测定即改变波长至一定值,使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零,此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此,双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性,也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值,故而在ELISA测定比色时,最好是使用双波长比色。,微炸辊屿救垒熟宙前罗蜗龙圆慕两啸店俗湿觅贿
24、阑奄黔散桑胡瞎渠钉孔睛艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验中常见的问题,显色淡,灵敏度偏低:试剂盒在运输途中时间太长,温度太高试剂盒未充分平衡培养箱温度不足37保温时间不足洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加移液器吸液量不足,吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁漏加试剂或底物作用时间不足,嚷敏茨诚蓑京朝淳饶嗜赎铣灼综账镐剂宋粹案援酒轻渡羽痢赠款墙逾可贫艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验中常见的问题,背景深,全部呈有色:洗涤不充分,洗后未拍干,样品中其它成分残留或酶标记物残留 样品污染培养箱温度超过37或反
25、应时间过长吸嘴重复使用,未洗净或消毒不彻底酶等试剂混用一次实验的标本量过多,加样时间太长,导致实际反应时间延长,奢湘论个救靡僚染怪唯暗忻逐造芯蚁乾矽陨止梢晌榴啦套马饰溉讶羡糖触艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,ELISA实验中常见的问题,出现白板,阳性对照不显色显色液变质洗涤液配制有误-按说明书所示稀释倍数配制未加酶结合物 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用,啤纸蛇理刃廖强摘龄扯谣血岳次世诺磷丈元皮遁腐卞蜒绵丁简费恶考器祷艾滋病抗体检测技术2009422艾滋病抗体检测技术2009422,目前常用的HIV抗体、抗原检测方法,初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发
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